As-Kip2在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的作用

发布时间：2017-09-20 05:02

  本文关键词：As-Kip2在中国卤虫滞育胚胎重启动过程中的作用

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【摘要】：中国卤虫(Artemia Sinica)又称为盐水丰年虫、盐水丰年虾等。属于节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),鳃足亚纲(Branchiopoda),无甲目(Anostaca),卤虫科(Artemiidae),卤虫属(Artemia)。卤虫是一种世界性分布的广温耐高盐的甲壳动物,广泛分布于内陆盐湖和海岸盐田中。在环境条件胁迫下,卤虫胚胎进入滞育阶段,如遇合适条件即可解除滞育重新启动发育,但其滞育胚胎重启动的分子机制一直没有研究清楚。Kip2又可称作p57Kip2、CDKI1C,属于细胞周期依赖激酶抑制因子(cyclin dependent kinases inhibitor,CDKI),是Cip/Kip家族的成员之一,是细胞周期的负调控蛋白。CDKI能够竞争性地与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDK)结合抑制其活性,使细胞周期停滞在G1期,从而实现对细胞周期的调节。本实验以中国卤虫为实验材料,利用分子生物学技术,首次克隆了As-Kip2基因,获得了1023bp的As-Kip2基因cDNA全序列。通过生物信息学分析发现,该基因包含一个492bp的开放阅读框,编码一个由163个氨基酸组成的蛋白。此蛋白的分子量大约为18.7kDa,等电点为9.45,具有一个CDI结构域。预测该蛋白有15个磷酸化位点,为疏水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。用Real-time qPCR技术,对As-Kip2在中国卤虫各发育时期、盐刺激、低温刺激时的表达量分别进行研究。发现As-Kip2随着发育的进行表达量逐渐增加,在低温及高盐等恶劣条件下表达量较高。推测这是因为在发育后期,低温和高盐条件时,As-Kip2使细胞周期停滞在G1期,细胞分裂和分化逐渐减慢。在环境条件胁迫下,卤虫胚胎进入滞育阶段。如遇合适条件,如适宜温度、盐度时,As-Kip2表达量下降,细胞周期正常进行,滞育解除重新启动发育。在利用原位杂交技术,对As-Kip2在卤虫发育各时期表达部位进行研究,发现As-Kip2在卤虫各时期各部位均有表达。利用Western blotting技术,在蛋白水平上研究As-Kip2蛋白在中国卤虫个发育时期、盐刺激、低温刺激时的表达量,发现随着发育的进行,温度逐渐降低,盐度逐渐升高,As-Kip2蛋白表达量逐渐增加,这与Real-time qPCR的结果相似,同时证明了该实验结果的可信性。该研究分析了As-Kip2在中国卤虫胚胎发育过程的表达模式,从而阐述了As-Kip2在卤虫发育阶段对细胞周期的调控及在卤虫滞育卵重新发育过程中的关键作用,为进一步研究滞育的形成及解除以及Kip2在脊椎动物中的深入研究提供了理论基础。
【关键词】：中国卤虫 Kip2基因 滞育
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 前言7-13
• 1.1 卤虫研究概述7-9
• 1.1.1 卤虫的形态特征7-8
• 1.1.2 卤虫的生活史8-9
• 1.2 Kip2基因的结构、功能及表达部位9-13
• 1.2.1 Kip2的结构9
• 1.2.2 Kip2的功能9-13
• 1.2.3 Kip2表达部位13
• 1.3 本研究的目的及意义13
• 2.实验材料及实验方法13-35
• 2.1 实验材料13-17
• 2.1.1 卤虫的培养13-14
• 2.1.2 主要仪器与设备14
• 2.1.3 实验主要试剂14-17
• 2.2 实验方法17-35
• 2.2.1 卤虫各时期总RNA的提取17
• 2.2.2 反转录cDNA17-18
• 2.2.3 PCR扩增18-23
• 2.2.4 As-Kip2的生物信息学分析23
• 2.2.5 实时定量PCR23-25
• 2.2.6 切片原位杂交25-28
• 2.2.7 原核表达28-33
• 2.2.8 免疫印迹试验33-35
• 3.实验结果35-49
• 3.1 As-Kip2 EST的获得35
• 3.2 RACE技术获得As-Kip2全序列35-37
• 3.3 信息学分析37-42
• 3.4 As-Kip2的表达模式42-44
• 3.4.1 As-Kip2在中国卤虫胚胎发育各时期的表达模式42-43
• 3.4.2 As-Kip2在盐胁迫时的表达模式43-44
• 3.4.3 As-Kip2在低温胁迫时的表达模式44
• 3.5 As-Kip基因在卤虫胚胎发育过程中的表达部位分析44-45
• 3.6 As-KIP2蛋白重组及原核表达45-47
• 3.7 Western Blotting47-49
• 3.7.1 As-KIP2蛋白在卤虫胚胎发育不同时期表达模式分析47-48
• 3.7.2 As-KIP2蛋白在盐刺激下表达模式分析48
• 3.7.3 As-KIP2蛋白在盐刺激下表达模式分析48-49
• 4.讨论49-52
• 4.1 中国卤虫As-Kip2基因全长及结构49-50
• 4.2 As-Kip2基因的表达模式50-51
• 4.2.1 As-Kip2基因不同时期的表达模式50
• 4.2.2 As-Kip2基因在盐度刺激下的表达模式50-51
• 4.2.3 As-Kip2基因在低温刺激下的表达模式51
• 4.3 As-Kip2基因在个发育阶段的表达部位51-52
• 4.4 As-KIP2重组蛋白表达52
• 4.5 As-KIP2蛋白的表达量52
• 5 结论52-54
• 参考文献54-57
• 致谢57

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1 周笃s，

本文编号：886038