青稞查尔酮合酶基因的克隆与原核表达

发布时间：2017-10-02 00:10

  本文关键词：青稞查尔酮合酶基因的克隆与原核表达

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【摘要】：青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. F)是我国青藏高原地区对多棱裸粒大麦的统称,即裸大麦。青稞不仅属于“三高两低”(高蛋白、高纤维、高维生素、低脂肪和低糖)食品,更含有丰富的功能活性成分如黄酮类化合物、γ-氨基丁酸、多酚类化合物、B族维生素以及β-葡聚糖等,这些营养物质对人的身体具有保健作用。随着人民生活水平的提高,青稞的营养价值亦受到更加重视。黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物,具有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、防止骨质疏松、保护肝脏等药理作用,是人们的理想保健物质。黄酮在植物中主要有黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等十几类,青稞中主要以黄酮醇为主。查尔酮合酶(CHS)为黄酮代谢途径的第一个关键限速酶,广泛分布在植物界,并且在植物的生长和适应环境活动中起着重要作用,近年来也成为分子生物学及植物生理学的研究热点之一。为了了解黄酮代谢途径中相关酶基因的作用,本实验以青稞“94-19-1”为材料,采用同源克隆的方式,克隆出了青稞查尔酮合酶基因的编码序列(Coding sequence,CDS)全长,并构建载体pET-32a-HvCHS,进行原核表达得到了其融合蛋白。本实验主要结果如下：1.采用同源克隆的方法获得了青稞CHS的CDS全长序列,全长为1351 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF)1197bp,该ORF编码398个氨基酸。序列分析表明：该基因编码蛋白分子量43.4 KDa,等电点为预测等电点(PI)为5.92,是酸性蛋白,该酶蛋白的不稳定系数(Ⅱ)为40.10(大于40),属于不稳定蛋白,预测其半衰期为30 h,平均亲水指数为-0.090,是亲水性蛋白。2. Blastn对比分析结果表明：该全长序列与大麦同源性最高,达到99%,与普通小麦同源性为91%；与水稻同源性为88%。与玉米同源性为85%；与高粱同源性为78%；与葡萄、矮牵牛、橄榄、马铃薯、西红柿等已知的CHS基因的同源性在65%-74%之间。进一步构建系统进化树显示青稞与单子叶植物的大麦、普通小麦的亲缘关系最近,相对双子叶植物如西红柿等关系较远。3.使用在线服务器PHYRE2 Server结合SOPMA软件对HvCHS酶蛋白的二级结构进行预测,发现HvCHS酶蛋白的二级结构主要由α-螺旋(41%)、无规则卷曲(12%)、及β-转角(15%)组成。进行蛋白质的N-糖基化和N-磷酸化预测,没有发现糖基化位点,却具丰富的磷酸化位点,9个丝氨酸(Ser)、6个苏氨酸(Thr)和2个酪氨酸(Tyr)存在磷酸化活性位点。4.将青稞CHS基因的编码序列与表达载体pET-32a连接后在大肠杆菌BL21中进行原核表达,发现CHS基因编码的蛋白与pET-32a表达载体上的标签蛋白形成64 KDa左右的融合蛋白。对其表达条件进行优化,发现融合蛋白最佳IPTG诱导浓度为1.0 mM,最佳诱导时间为3 h。
【关键词】：大麦 青稞 查尔酮合酶 同源克隆 原核表达
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S512.3;Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1 黄酮概述11-14
• 1.1 基本结构及分类11-12
• 1.2 生物学功能12-13
• 1.3 代谢途径13-14
• 2 查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)14-18
• 2.1 查尔酮合酶蛋白结构及反应机理14-16
• 2.2 查尔酮合成酶基因结构16
• 2.3 查尔酮合成酶基因的进化16-17
• 2.4 查尔酮合成酶基因表达的调控17
• 2.5 查尔酮合成酶基因的转基因应用17-18
• 3 大麦(青稞)18-19
• 4 实验目的与意义及研究内容19-21
• 第二章 青稞查尔酮合酶基因的克隆21-35
• 1. 材料与方法21-27
• 1.1 材料21-22
• 1.1.1 材料与菌株21
• 1.1.2 主要试剂与药品21
• 1.1.3 试剂的配置21-22
• 1.1.4 主要仪器22
• 1.2 方法22-27
• 1.2.1 总RNA的提取22-23
• 1.2.2 总RNA的纯度和浓度的检测23
• 1.2.3 第一链cDNA的制备23-24
• 1.2.4 PCR扩增24
• 1.2.5 PCR产物的克隆24-25
• 1.2.6 目的片段回收25
• 1.2.7 连接与转化25-26
• 1.2.8 阳性克隆的筛选和鉴定26-27
• 2 结果与分析27-33
• 2.1 RNA完整性和纯度检测27
• 2.2 同源克隆27-28
• 2.2.1 PCR扩增产物27-28
• 2.3 生物信息学分析28-33
• 2.3.1 碱基序列分析28-29
• 2.3.2 氨基酸序列分析29-30
• 2.3.3 HvCHS蛋白一二级结构分析30-32
• 2.3.4 HvCHS蛋白三级结构分析32-33
• 3 讨论33-35
• 3.1 RNA的提取33
• 3.2 青稞查尔酮合酶基因的同源克隆33-35
• 第三章 青稞查尔酮合酶基因的原核表达35-46
• 1 材料与方法35-41
• 1.1 材料35-36
• 1.1.1 质粒与菌株35
• 1.1.2 主要试剂35
• 1.1.3 试剂的配置35-36
• 1.1.4 实验仪器36
• 1.2 方法36-41
• 1.2.1 CHS基因酶切引物设计36-37
• 1.2.2 PCR扩增37
• 1.2.3 PCR产物回收纯化37
• 1.2.4 CHS基因与T载体连接37
• 1.2.5 CHS基因转化与鉴定37
• 1.2.6 原核表达载体的构建37-39
• 1.2.7 重组蛋白的诱导表达39-40
• 1.2.8 SDS-PAGE电泳40-41
• 2 结果41-43
• 2.1 双酶切41-42
• 2.2 青稞CHS基因的原核表达42-43
• 2.3 青稞CHS基因的原核表达条件的优化43
• 3 讨论43-46
• 3.1 原核表达载体43-44
• 3.2 载体构建44-45
• 3.3 青稞HvCHS基因表达蛋白45-46
• 第四章 结论与展望46-48
• 1 结论46
• 2 展望46-48
• 参考文献48-55
• 致谢55-57
• 攻读硕士期间发表的学术论文57

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