SPAG6基因沉默对SKM-1细胞自噬的影响及机制研究
发布时间：2021-04-02 22:55
目的:构建pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体在MDS细胞株中靶向抑制精子相关抗原6（sperm-associated antigen 6,SPAG6）基因的表达,探索SPAG6基因沉默对SKM-1细胞自噬的影响及可能的分子机制,并初步探讨在SKM-1细胞中细胞自噬与细胞凋亡之间的关系。方法:1.筛选慢病毒靶向沉默SPAG6基因表达的最佳序列并构建SPAG6-/-型稳定感染的SKM-1细胞株模型:体外培养SKM-1细胞分别感染阴性对照慢病毒载体（NC-shRNA）和靶向抑制SPAG6基因表达慢病毒载体（SPAG6-shRNA）,荧光倒置显微镜观察SKM-1细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达情况,0.5μg/ml嘌呤霉素筛选稳定感染的SKM-1细胞株2周,并用流式细胞仪检测慢病毒感染效率;qRT-PCR和Western blot法验证SPAG6基因的干扰效果。2.探索SPAG6基因沉默对SKM-1细胞自噬和凋亡的影响:qRT-PCR检测NC-shRNA和SPAG6-shRNA两组细胞内自噬相关基因mRNA的表达水平;透射电子显微镜（TEM）检测自噬小体的表达情况;Western bl...
【文章来源】： 张梦 重庆医科大学
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SPAG6-/-型稳定感染的SKM-1细胞株模型成功构建Figure1．TheSPAG6-/-infectedSKM-1celllinewassuccessfullyestablished.SKM-1cellsweretransfectedwithGFP-taggedlentiviruswithshRNAtargetingSPAG6and
重庆医科大学硕士研究生学位论文26图2.SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生自噬Figure2.SPAG6silencinginducesautophagyinSKM-1cells.(A)RelativemRNAexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingqRTPCR.(B)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,p62,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingwesternblot-analysis.GAPDHwasusedasaloadingcontrol.(C)Transmissionelectronmicroscopyrevealedtheintracellularultrastructuresineachgroup(magnification,x20,000).Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.Redarrowsindicateautophagicvacuoles.Scalebar,1μm.(D)Numberofautophagosomesperfieldwasquantified.Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.*P<0.05;**P<0.01vs.NCshRNA.2.3SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生凋亡为了研究SPAG6基因对SKM-1细胞凋亡的影响，首先采用Westernblot检测两组细胞中凋亡相关的蛋白的表达情况。结果表明，与NC-shRNA组相比，SPAG6-shRNA组Bax和cleavedcaspase-3蛋白的表达增加，Bcl-2的表达水平降低（图3A）。为了进一步验证SPAG6与SKM-1细胞凋亡之间的关系，使用流式细胞术检测两组细胞凋亡率，发现SPAG6-shRNA组细胞凋亡率高于NC-shRNA组（图3B和3C）。以上结果表明，SPAG6基因沉默可诱导SKM-1细胞发生凋亡，SPAG6基因作为癌基因参与MDS的发病，与课题组既往研究结果相一致[17-19]。
重庆医科大学硕士研究生学位论文27图3.SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生凋亡Figure3.SPAG6downregulationtriggersapoptosisinSKM-1cells.(A)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,Bcl-2,Baxandcleavedcaspase-3ineachgroupweredetectedusingwesternblotanalysis.(B)AfterannexinVAPC/DAPIdouble-staining,thetotalapoptosisrateofSKM1cellstreatedwithNC-shRNAorSPAG6-shRNAwasdetectedbyflowcytometry.Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.(C)Analysisoftheapoptoticrateshownin(B).Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.**P<0.01vs.NC-shRNA.2.4抑制自噬可减弱SPAG6基因沉默诱导的SKM-1细胞凋亡自噬和凋亡均是细胞程序性死亡的方式，两者之间紧密联系，共同调控细胞的生长。研究发现，在某些肿瘤中，激活自噬可增加肿瘤细胞的凋亡[23-24]。为了探讨SPAG6基因沉默诱导的自噬与细胞凋亡之间的关系，应用自噬抑制剂3-MA
本文编号：3116115
【文章来源】： 张梦 重庆医科大学
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SPAG6-/-型稳定感染的SKM-1细胞株模型成功构建Figure1．TheSPAG6-/-infectedSKM-1celllinewassuccessfullyestablished.SKM-1cellsweretransfectedwithGFP-taggedlentiviruswithshRNAtargetingSPAG6and
重庆医科大学硕士研究生学位论文26图2.SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生自噬Figure2.SPAG6silencinginducesautophagyinSKM-1cells.(A)RelativemRNAexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingqRTPCR.(B)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,LC3,Beclin1,p62,ATG5andATG7ineachgroupweredetectedusingwesternblot-analysis.GAPDHwasusedasaloadingcontrol.(C)Transmissionelectronmicroscopyrevealedtheintracellularultrastructuresineachgroup(magnification,x20,000).Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.Redarrowsindicateautophagicvacuoles.Scalebar,1μm.(D)Numberofautophagosomesperfieldwasquantified.Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.*P<0.05;**P<0.01vs.NCshRNA.2.3SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生凋亡为了研究SPAG6基因对SKM-1细胞凋亡的影响，首先采用Westernblot检测两组细胞中凋亡相关的蛋白的表达情况。结果表明，与NC-shRNA组相比，SPAG6-shRNA组Bax和cleavedcaspase-3蛋白的表达增加，Bcl-2的表达水平降低（图3A）。为了进一步验证SPAG6与SKM-1细胞凋亡之间的关系，使用流式细胞术检测两组细胞凋亡率，发现SPAG6-shRNA组细胞凋亡率高于NC-shRNA组（图3B和3C）。以上结果表明，SPAG6基因沉默可诱导SKM-1细胞发生凋亡，SPAG6基因作为癌基因参与MDS的发病，与课题组既往研究结果相一致[17-19]。
重庆医科大学硕士研究生学位论文27图3.SPAG6基因沉默诱导SKM-1细胞发生凋亡Figure3.SPAG6downregulationtriggersapoptosisinSKM-1cells.(A)RelativeproteinexpressionlevelsofSPAG6,Bcl-2,Baxandcleavedcaspase-3ineachgroupweredetectedusingwesternblotanalysis.(B)AfterannexinVAPC/DAPIdouble-staining,thetotalapoptosisrateofSKM1cellstreatedwithNC-shRNAorSPAG6-shRNAwasdetectedbyflowcytometry.Theimagesdisplayarepresentativeexperimentfromthreeindependentexperiments.(C)Analysisoftheapoptoticrateshownin(B).Dataarepresentedasthemean±standarddeviationofthreeindependentexperiments.**P<0.01vs.NC-shRNA.2.4抑制自噬可减弱SPAG6基因沉默诱导的SKM-1细胞凋亡自噬和凋亡均是细胞程序性死亡的方式，两者之间紧密联系，共同调控细胞的生长。研究发现，在某些肿瘤中，激活自噬可增加肿瘤细胞的凋亡[23-24]。为了探讨SPAG6基因沉默诱导的自噬与细胞凋亡之间的关系，应用自噬抑制剂3-MA
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