p53 -/- mBMMSC-exosome内UBR2在胃癌发展中的作用和机制
发布时间：2021-05-06 04:20
目的:骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC）参与肿瘤微环境的组成,但p53缺陷的BMMSC(p53-/-BMMSC)在其中的作用及机制并不清楚,外泌体（exosome）是BMMSC旁分泌的主要成分,p53-/-BMMSC-exosome在胃癌发展中的作用尚未报道。本研究旨在揭示p53-/-BMMSC-exosome内的泛素蛋白连接酶E3α2（Ubiquitin ligase E3 alpha II,UBR2）在胃癌发展中的作用及机制,为胃癌诊断和治疗提供新的思路和依据。方法:采用透射电子显微镜观察p53+/+mBMMSC（mouse bone marrow mesenchymal stem cell,m BMMSC）和p53-/-mBMMSC分泌的exosome形态和直径大小;通过Nanosight纳米颗粒分析仪对p53+/+m BMMSC和p53-/-mBMMSC分泌的exo...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词中英文注释表
第一章 绪论
1.1 概述
1.2 间质干细胞
1.2.1 间质干细胞的特性
1.2.2MSC与肿瘤微环境
1.2.3 MSC与p53
1.3 Exosome
1.3.1 Exosome的生物学特性、生成与释放
1.3.2 Exosome的结构和来源
1.3.3 Exosome与肿瘤
1.4 UBR2蛋白及功能
1.5 研究目的、方法、技术路线和意义
1.5.1 研究目的
1.5.2 研究方法
1.5.3 技术路线
1.5.4 研究意义
第二章 mBMMSC分泌Exosome的鉴定与比较
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要的仪器及相关耗材
2.2 方法
2.2.1 mBMMSC的分离与培养
2.2.2 细胞冻存
2.2.3 细胞复苏
2.2.4 去除exosome胎牛血清制备
2.2.5 细胞上清制备
2.2.6 细胞上清exosome提取
2.2.7 透射电镜观察exosome的形态
2.2.8 Nanosight分析exosome的数量及大小
2.2.9 Western blot检测exosome标志物
2.2.10 统计分析
2.3 结果
2.3.1 透射电镜鉴定p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC来源的exosome
2.3.2 Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪鉴定细胞来源的exosome
2.3.3 Western blot检测p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC上清来源的exosome表面标记
2.4 讨论
第三章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome在胃癌发展中的作用
3.1 材料
3.1.1 动物
3.1.2 试剂
3.1.3 主要的仪器与相关器材
3.2 方法
3.2.1 激光共聚焦显微镜观察exosome细胞内定位
3.2.2 流式成像技术检测exosome细胞内定位
3.2.3 平板克隆增殖实验
3.2.4 Transwell迁移实验
3.2.5 总RNAs的提取
3.2.6 RNA逆转录
3.2.7 实时荧光定量PCR
3.2.8 细胞蛋白的提取
3.2.9 Western blot
3.2.10 裸鼠皮下瘤模型构建
3.2.11 免疫组化检测及结果判断
3.3 结果
3.3.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome对p53~(+/+)mBMMSC生物学功能的影响
3.3.1.1 p53~(+/+)mBMMSC内化p53~(-/-)mBMMSC-exosome
3.3.1.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC的增殖
3.3.1.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表达
3.3.1.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高p53~(+/+)mBMMSC的迁移能力
3.3.1.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC细胞的EMT
3.3.1.6 p53~(-/-)mBMMSC-exosome诱导后的p53~(+/+)mBMMSC促进胃癌体内成瘤能力
3.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome对MFC生物学功能的影响
3.3.2.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC的增殖
3.3.2.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC干性基因的表达
3.3.2.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高MFC的迁移能力
3.3.2.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC的EMT
3.3.2.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC体内成瘤能力
3.4 讨论
第四章 UBR2在胃癌进展中的作用
4.1 材料
4.1.1 动物
4.1.2 试剂
4.1.3 主要的仪器与相关器材
4.2 方法
4.2.1 RNA的提取、逆转录、荧光定量PCR
4.2.2 细胞蛋白提取、Western blot
4.2.3 免疫组化
4.2.4 Nanosight分析exosome的数量
4.2.5 Exosome内总RNA的提取
4.2.6 UBR2干扰
4.2.7 平板克隆增殖实验
4.2.8 Transwell迁移实验
4.3 结果
4.3.1 p53~(-/-)mBMMSC细胞及其exosome中UBR2表达明显高于p53~(+/+)mBMMSC
4.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome能传递UBR2至p53~(+/+)mBMMSC和MFC
4.3.3 UBR2蛋白的功能
4.3.3.1 UBR2干扰抑制exosome的分泌
4.3.3.2 UBR2干扰降低p53~(-/-)mBMMSC细胞的增殖
4.3.3.3 UBR2干扰降低p53~(-/-)mBMMSC细胞的干性基因的表达
4.3.3.4 UBR2干扰抑制p53~(-/-)mBMMSC细胞的迁移能力
4.3.3.5 UBR2干扰抑制p53~(-/-)mBMMSC细胞的EMT
4.4 讨论
第五章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome内UBR2在胃癌发展中的作用
5.1 材料
5.1.1 试剂
5.1.2 主要的仪器与相关器材
5.2 方法
5.2.1 RNA的提取、逆转录、荧光定量PCR
5.2.2 细胞蛋白提取、Western blot
5.2.3 UBR2干扰
5.2.4 平板克隆增殖实验
5.2.5 Transwell迁移实验
5.2.6 Exosome的提取
5.2.7 免疫荧光
5.3 结果
5.3.1 敲减UBR2后的p53~(-/-)mBMMSC-exosome对p53~(+/+)mBMMSC细胞生物学功能的影响
5.3.1.1 UBR2敲减exosome作用p53~(+/+)mBMMSC后UBR2验证
5.3.1.2 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的增殖能力
5.3.1.3 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表达
5.3.1.4 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的迁移能力
5.3.1.5 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的EMT
5.3.2 敲减UBR2后p53~(-/-)mBMMSC-exosome对MFC生物学功能的影响
5.3.2.1 UBR2敲减exosome作用MFC后UBR2表达下调
5.3.2.2 UBR2敲减exosome抑制MFC的增殖能力
5.3.2.3 UBR2敲减exosome抑制MFC的干性基因表达
5.3.2.4 UBR2敲减exosome抑制MFC的迁移能力
5.3.2.5 UBR2敲减exosome抑制MFC的EMT
5.3.3 UBR2对Wnt/β-catenin信号通路的调控
5.4 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议
一、发表论文
二、参加会议
三、获奖情况
本文编号：3171225
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
英文缩略词中英文注释表
第一章 绪论
1.1 概述
1.2 间质干细胞
1.2.1 间质干细胞的特性
1.2.2MSC与肿瘤微环境
1.2.3 MSC与p53
1.3 Exosome
1.3.1 Exosome的生物学特性、生成与释放
1.3.2 Exosome的结构和来源
1.3.3 Exosome与肿瘤
1.4 UBR2蛋白及功能
1.5 研究目的、方法、技术路线和意义
1.5.1 研究目的
1.5.2 研究方法
1.5.3 技术路线
1.5.4 研究意义
第二章 mBMMSC分泌Exosome的鉴定与比较
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要的仪器及相关耗材
2.2 方法
2.2.1 mBMMSC的分离与培养
2.2.2 细胞冻存
2.2.3 细胞复苏
2.2.4 去除exosome胎牛血清制备
2.2.5 细胞上清制备
2.2.6 细胞上清exosome提取
2.2.7 透射电镜观察exosome的形态
2.2.8 Nanosight分析exosome的数量及大小
2.2.9 Western blot检测exosome标志物
2.2.10 统计分析
2.3 结果
2.3.1 透射电镜鉴定p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC来源的exosome
2.3.2 Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪鉴定细胞来源的exosome
2.3.3 Western blot检测p53~(+/+)mBMMSC和p53~(-/-)mBMMSC上清来源的exosome表面标记
2.4 讨论
第三章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome在胃癌发展中的作用
3.1 材料
3.1.1 动物
3.1.2 试剂
3.1.3 主要的仪器与相关器材
3.2 方法
3.2.1 激光共聚焦显微镜观察exosome细胞内定位
3.2.2 流式成像技术检测exosome细胞内定位
3.2.3 平板克隆增殖实验
3.2.4 Transwell迁移实验
3.2.5 总RNAs的提取
3.2.6 RNA逆转录
3.2.7 实时荧光定量PCR
3.2.8 细胞蛋白的提取
3.2.9 Western blot
3.2.10 裸鼠皮下瘤模型构建
3.2.11 免疫组化检测及结果判断
3.3 结果
3.3.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome对p53~(+/+)mBMMSC生物学功能的影响
3.3.1.1 p53~(+/+)mBMMSC内化p53~(-/-)mBMMSC-exosome
3.3.1.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC的增殖
3.3.1.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表达
3.3.1.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高p53~(+/+)mBMMSC的迁移能力
3.3.1.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进p53~(+/+)mBMMSC细胞的EMT
3.3.1.6 p53~(-/-)mBMMSC-exosome诱导后的p53~(+/+)mBMMSC促进胃癌体内成瘤能力
3.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome对MFC生物学功能的影响
3.3.2.1 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC的增殖
3.3.2.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC干性基因的表达
3.3.2.3 p53~(-/-)mBMMSC-exosome提高MFC的迁移能力
3.3.2.4 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC的EMT
3.3.2.5 p53~(-/-)mBMMSC-exosome促进MFC体内成瘤能力
3.4 讨论
第四章 UBR2在胃癌进展中的作用
4.1 材料
4.1.1 动物
4.1.2 试剂
4.1.3 主要的仪器与相关器材
4.2 方法
4.2.1 RNA的提取、逆转录、荧光定量PCR
4.2.2 细胞蛋白提取、Western blot
4.2.3 免疫组化
4.2.4 Nanosight分析exosome的数量
4.2.5 Exosome内总RNA的提取
4.2.6 UBR2干扰
4.2.7 平板克隆增殖实验
4.2.8 Transwell迁移实验
4.3 结果
4.3.1 p53~(-/-)mBMMSC细胞及其exosome中UBR2表达明显高于p53~(+/+)mBMMSC
4.3.2 p53~(-/-)mBMMSC-exosome能传递UBR2至p53~(+/+)mBMMSC和MFC
4.3.3 UBR2蛋白的功能
4.3.3.1 UBR2干扰抑制exosome的分泌
4.3.3.2 UBR2干扰降低p53~(-/-)mBMMSC细胞的增殖
4.3.3.3 UBR2干扰降低p53~(-/-)mBMMSC细胞的干性基因的表达
4.3.3.4 UBR2干扰抑制p53~(-/-)mBMMSC细胞的迁移能力
4.3.3.5 UBR2干扰抑制p53~(-/-)mBMMSC细胞的EMT
4.4 讨论
第五章 P53~(-/-)mBMMSC-Exosome内UBR2在胃癌发展中的作用
5.1 材料
5.1.1 试剂
5.1.2 主要的仪器与相关器材
5.2 方法
5.2.1 RNA的提取、逆转录、荧光定量PCR
5.2.2 细胞蛋白提取、Western blot
5.2.3 UBR2干扰
5.2.4 平板克隆增殖实验
5.2.5 Transwell迁移实验
5.2.6 Exosome的提取
5.2.7 免疫荧光
5.3 结果
5.3.1 敲减UBR2后的p53~(-/-)mBMMSC-exosome对p53~(+/+)mBMMSC细胞生物学功能的影响
5.3.1.1 UBR2敲减exosome作用p53~(+/+)mBMMSC后UBR2验证
5.3.1.2 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的增殖能力
5.3.1.3 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC干性基因的表达
5.3.1.4 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的迁移能力
5.3.1.5 UBR2敲减exosome抑制p53~(+/+)mBMMSC的EMT
5.3.2 敲减UBR2后p53~(-/-)mBMMSC-exosome对MFC生物学功能的影响
5.3.2.1 UBR2敲减exosome作用MFC后UBR2表达下调
5.3.2.2 UBR2敲减exosome抑制MFC的增殖能力
5.3.2.3 UBR2敲减exosome抑制MFC的干性基因表达
5.3.2.4 UBR2敲减exosome抑制MFC的迁移能力
5.3.2.5 UBR2敲减exosome抑制MFC的EMT
5.3.3 UBR2对Wnt/β-catenin信号通路的调控
5.4 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文及参加会议
一、发表论文
二、参加会议
三、获奖情况
本文编号：3171225
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