人乳铁蛋白基因定点敲入β乳球蛋白位点基因打靶奶山羊的研制

发布时间：2020-10-21 00:14

　　 山羊乳被誉为“奶中之王”,但部分人群会产生羊乳过敏症状,β乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是羊乳过敏的主要过敏原。先前的研究试图通过许多生化方法对羊乳进行加工以降低BLG的致敏性,但同时也会改变乳汁中其他组分,降低羊乳的营养价值。基因打靶技术被认为是减少甚至消除羊乳中BLG过敏原、彻底解决BLG乳过敏症最直接的方法。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是一种转铁蛋白家族的铁离子结合多功能糖蛋白,具有抗菌、抗病毒、抗炎等免疫调节功能。本研究分别利用ZFN和TALEN技术介导外源hLF基因定点敲入奶山羊BLG位点,生产hLF基因定点敲入BLG位点基因打靶奶山羊,使奶山羊乳汁中过敏原BLG降低的同时在乳汁中增加了外源蛋白hLF,这样不仅可以平衡乳蛋白成分又可以增强山羊乳的免疫调节功能,生产具有更高营养价值的“人源化”山羊乳。研究的主要内容如下:1.基因打靶载体的构建。以奶山羊血液基因组DNA、人外周血中性粒细胞cDNA和pVAX1?载体为模板分别扩增了877 bp和780 bp的5’和3’同源臂序列、hLF编码序列和bGH polyA序列,将扩增的目的片段测序后先后克隆于含有neo筛选标记基因打靶载体骨架ploxp上构建了基因打靶载体pG,其中hLF-bGH polyA置于5’同源臂序列的下游,筛选标记基因的两侧含有同向的Loxp位点。将该载体转化可表达Cre酶的大肠杆菌BM25.8后,提取重组质粒进行鉴定,结果表明打靶载体上的Loxp位点可以有效地去除筛选标记基因。以打靶载体pG和pB52T3载体为模板分别扩增了BLG5-hLF-bGH polyA、BLG3和loxp-EFα-EGFP-p2A-puro-loxp序列,将扩增的目的片段测序后先后克隆于骨架载体pMD-19-T上构建了含EGFP和puro双筛选标记的打靶载体pSHQ。2.基因打靶载体功能验证。将ZFN或TALEN表达载体与基因打靶载体pG共转染奶山羊胎儿成纤维细胞(goat fetal fibroblasts,GFFs),junction PCR结果显示单纯转染基因打靶载体pG的细胞中未能扩增出目的条带,共转染ZFN或TALEN与pG的细胞中均可扩增出目的条带,表明ZFN与TALEN均可以介导hLF基因定位整合至BLG基因位点,提高基因敲入的效率。将基因打靶载体pG与TALEN质粒共转染奶山羊乳腺上皮细胞,应用G418筛选抗性克隆,对G418抗性克隆扩大培养后进行激素诱导,应用RT-PCR和western blot对外源基因hLF的表达进行检测,结果表明基因打靶载体pG由TALEN介导发生同源重组后可以实现外源基因hLF的表达。3.ZFN与TALEN介导hLF定向整合至BLG位点的效率检测。将ZFN与TALEN表达载体或mRNA分别与基因打靶载体pG共转染GFFs,应用G418筛选抗性克隆,junction PCR、long-range PCR和测序方法鉴定检测ZFN与TALEN介导hLF定向整合至BLG位点的效率,结果显示针对BLG第一外显子,ZFN与TALEN介导hLF定向整合的打靶效率是:TALEN转染质粒组共筛选到G418抗性克隆996个,阳性克隆数127个,阳性细胞克隆率为12.8%;ZFN转染质粒组共筛选到G418抗性克隆832个,阳性克隆数69个,阳性细胞克隆率为8.3%;TALEN转染mRNA组共筛选到G418抗性克隆810个,阳性克隆数73个,阳性细胞克隆率为9.0%;ZFN转染mRNA组共筛选到G418抗性克隆821个,阳性克隆数48个,阳性细胞克隆率为5.8%。TALEN介导的基因敲入效率高于ZFN,转染表达质粒组的打靶效率高于转染mRNA组,由于转染表达质粒具有随机整合的弊端,选择转染mRNA组的阳性细胞克隆进行体细胞核移植。4.体细胞核移植生产基因打靶克隆奶山羊。将染色体数为60条,核型正常且细胞状态良好的细胞克隆应用于体细胞核移植,核移植后克隆胚胎的融合率、卵裂率和囊胚率与母本野生型细胞均没有显著差异的细胞克隆选择用于生产克隆胚胎并进行胚胎移植,共移植受体羊37只,最终生产并存活的转基因羊4只(3只来自TALEN介导组,1只来自ZFN介导组),经PCR、测序以及southern blot鉴定,4只转基因奶山羊均为单等位基因敲入的基因打靶克隆奶山羊,测序结果显示hLF的编码序列成功置换至BLG基因的第一外显子信号肽序列的下游,BLG基因的17 bp基因序列被置换。5.基因打靶奶山羊的繁殖性能分析及乳汁成分检测。对基因打靶克隆奶山羊的繁殖性能指标检测结果显示基因打靶克隆奶山羊均可以正常发情,发情周期和发情时间与野生型奶山羊没有显著差异,经配种,四只基因打靶奶山羊均正常妊娠,并产下后代,经PCR、测序及southern blot鉴定其中一只后代为单等位基因敲入的基因打靶克隆奶山羊,表明通过TALEN介导的靶向基因修饰可以通过遗传的方式传递给后代。基因打靶奶山羊正常产仔后,对其乳汁成分进行分析,SDS-PAGE、western blot、Q-PCR等分析结果显示基因打靶奶山羊乳汁中外源基因hLF成功表达且BLG基因表达下调,其它蛋白成分均未发生显著变化。对基因打靶奶山羊乳汁中脂肪、总蛋白、乳糖和干物质组成含量分析,结果显示与野生型奶山羊乳汁成分相比,各组分均没有显著差异。综上所述,本研究应用ZFN与TALEN介导外源基因hLF靶向整合至BLG位点,并且结合体细胞核移植技术生产基因打靶克隆奶山羊,完善了应用人工核酸酶介导基因敲入方法生产基因编辑克隆动物的技术体系。此外,基因打靶克隆奶山羊的乳汁中不仅消除了部分BLG蛋白,而且在不破坏乳汁组分的前提下又添加了有益蛋白hLF,为乳制品的营养价值的提高及奶山羊新品种的培育奠定了坚实基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S827
【部分图文】：

促使 FokI 形成二聚体，才能发生切割作用(Smith et al. 2000)（图2-1）。2.2.1.2 ZFN 的构建 ZFN 的构建方法目前包括模块组装法、寡聚文库构建组装法、上下文依赖组装法和CompoZr 组装法。 图 2-1 锌指模块和锌指核酸酶的结构(Hauschild-Quintern et al. 2013)Fig.2-1 Structure of zinc finger and zinc finger nucleases(Hauschild-Quintern et al. 2013)7

装法(modular assembly)：模块组装法（图 2-2a）是将预先筛选好，根据识别序列的要求，将这些独立模块选择好串联到一起，这一到了 ZF 结构可以特异地识别 DNA 序列，没有考虑到将不同 ZF 模间的连接会影响模块识别 DNA 的特异性(Isalan et al. 1997)。因此于所使用模块的质量以及模块之间的互通性，研究表明模块组装高的失败率，Cherie L Ramirez 等(2008a)应用模块组装法针对 104 对 ZFNs，通过酵母双杂交的方法检测与 DNA 结合的效率，结果

s 的 DNA 识别密码与 TALENs 的结构(Mussolino and CALEs 的拓扑异构结构和与 DNA 碱基之间的连接(Mak ey and contacts between TAL effector repeats and DNA base
【参考文献】

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1 BAO Lei;CHEN HaiDe;JONG UiMyong;RIM CholHo;LI WenLing;LIN XiJuan;ZHANG Dan;LUO Qiong;CUI Chun;HUANG HeFeng;ZHANG Yan;XIAO Lei;FU ZhiXin;;Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

本文编号：2849351