犬Tetherin因子抗流感病毒的研究及犬肺MicroRNA表达差异分析

发布时间：2023-10-08 19:32

　　犬流感病毒(Canine Influenza Virus,CIV)是能够引起犬只体温升高、喷嚏、流涕等临床症状的甲型流感病毒,常常继发其他病毒性疾病和细菌性疾病,严重时可造成呼吸衰竭而死亡。在我国,CIV主要是来源于禽的H3N2亚型流感病毒,经过长时间的适应进化已经能够在犬群中稳定传播。犬的数量庞大,在全球至少有七亿只,并且大部分是作为人类的宠物伴侣,与人类的关系非常密切。由于犬的呼吸道具有SAα-2,3和SAα-2,6两种受体,因此可以同时感染禽流感病毒和人流感病毒,可能成为导致流感病毒基因重排的潜在的“混合器”。因此,开展犬流感的相关研究对公共卫生和人类健康的意义重大。天然免疫限制因子Tetherin,又称为BST-2,CD317或者HM1.24,是Ⅰ型干扰素(Interferon,IFN)诱导产生的跨膜蛋白。Tetherin具有广谱性的抗病毒活性,利用自身特殊的拓扑结构在病毒出芽过程中将病毒粒子连接在细胞膜表面,限制病毒的有效释放。本文首次研究了犬Tetherin限制CIV复制的能力和作用机制,结果如下:1.利用RT-PCR扩增比格犬Tetherin基因,将其克隆到p3×FLAG...

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 流感病毒概述
        1.1.2 犬流感的流行情况
            1.1.2.1 马源H3N8流感病毒感染犬
            1.1.2.2 禽源H3N2流感病毒感染犬
            1.1.2.3 禽源H5N1流感病毒感染犬
            1.1.2.4 其他亚型流感病毒感染犬
        1.1.3 犬流感病毒粒子的形态和构成
        1.1.4 犬流感病毒编码的蛋白和功能
        1.1.5 天然免疫限制因子Tetherin研究概述
            1.1.5.1 Tetherin的分子特征和细胞定位
            1.1.5.2 Tetherin抗病毒机制
            1.1.5.3 抗Tetherin的病毒拮抗蛋白
        1.1.6 MicroRNA研究概括
            1.1.6.1 MicroRNA的合成途径及作用机制
            1.1.6.2 MicroRNA与流感病毒
    1.2 研究目的及意义
    1.3 研究技术路线
第2章 犬天然免疫因子Tetherin抑制流感病毒机制的研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 毒株、质粒和细胞
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 主要仪器
        2.2.4 相关试剂配置
    2.3 实验方法
        2.3.1 引物设计
        2.3.2 犬外周血淋巴细胞分离
        2.3.3 细胞总RNA的提取及其反转录
        2.3.4 Tetherin基因片段的扩增与克隆
        2.3.5 真核表达质粒构建及蛋白表达
        2.3.6 筛选稳定表达细胞系
        2.3.7 病毒空斑纯化及病毒滴度测定
            2.3.7.1 空斑实验的基本过程
            2.3.7.2 空斑纯化
            2.3.7.3 病毒PFU的测定
        2.3.8 病毒EID50测定
        2.3.9 间接免疫荧光实验
        2.3.10 双分子荧光互补(BiFC)实验
        2.3.11 免疫共沉淀(Co-IP)
        2.3.12 蛋白免疫印迹(Westernblot)
        2.3.13 生物信息网站及软件
    2.4 结果与分析
        2.4.1 犬Tetherin的生物信息学分析
            2.4.1.1 犬Tetherin基因的扩增
            2.4.1.2 犬Tetherin序列的分析
            2.4.1.3 犬Tetherin蛋白结构预测
        2.4.2 犬Tetherin组织表达谱分析
        2.4.3 犬Tetherin蛋白表达与定位
        2.4.4 构建稳定表达Tetherin的细胞系
        2.4.5 犬干扰素和CIV对犬Tetherin的诱导调控研究
            2.4.5.1 犬Tetherin启动子序列分析
            2.4.5.2 犬干扰素对犬Tetherin的诱导表达
            2.4.5.3 CIV对犬Tetherin的诱导表达
        2.4.6 CCK-8测定稳定表达细胞系对CIV的抵抗能力
        2.4.7 Tetherin对CIV在细胞增殖能力的影响
        2.4.8 干扰Tetherin基因对CIV在细胞增殖能力的影响
        2.4.9 Tetherin与流感相互作用的蛋白
    2.5 本章小结
第3章 攻毒犬肺MicroRNA的表达差异分析
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 毒株、质粒、主要试剂和仪器
        3.2.2 实验动物
    3.3 实验方法
        3.3.1 比格犬攻毒实验
        3.3.2 病毒TCID50测定
        3.3.3 血凝抑制试验
        3.3.4 犬肺组织HE及IHC
        3.3.5 总RNA提取
        3.3.6 高通量测序
        3.3.7 荧光定量PCR验证
            3.3.7.1 MicroRNAcDNA第一链的合成
            3.3.7.2 MicroRNA引物设计
            3.3.7.3 荧光定量PCR反应体系配制
        3.3.8 差异表达MicroRNA目标预测和功能分析
        3.3.9 双萤光报告载体的构建
        3.3.10 双萤光素酶检测
        3.3.11 数据的统计与分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 CIV对犬致病性的研究
        3.4.2 MicroRNA分析
            3.4.2.1 测序结果的序列长度分布
            3.4.2.2 犬肺组织MicroRNA表达谱分析
            3.4.2.3 GO功能显著性富集分析
            3.4.2.4 KEGG通路富集分析
            3.4.2.5 深度测序的MicroRNAqRT-PCR验证
        3.4.3 MicroRNA与Tetherin
            3.4.3.1 预测靶向Tetherin下游UTR区域的MicroRNA
            3.4.3.2 qPCR验证预测的MicroRNA
            3.4.3.3 双萤光素酶检测
    3.5 本章小结
全文讨论与总结
致谢
参考文献
附录 研究生期间发表的文章



本文编号：3852650