microRNA-7调控胃癌恶性生物学行为的功能与分子机制研究

发布时间：2017-10-22 10:12

  本文关键词：microRNA-7调控胃癌恶性生物学行为的功能与分子机制研究

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【摘要】：【背景】胃癌是我国乃至世界范围内发病率和病死率均位居前列的恶性肿瘤。胃癌的发生是多种恶性生物学表型相互交织、相互影响、相互促进的序贯过程,其本质是细胞中分子事件从稳态走向紊乱的总和。因此,研究胃癌发生过程中的关键分子事件,阐明其中的分子调控机制,将为胃癌临床治疗提供新的思路和方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年发现的一类在真核细胞中发挥重要调控作用的内源性非编码RNA。mi RNA通过与蛋白编码基因m RNA结合,在转录后水平抑制基因表达,从而调控机体的生长发育和疾病发生过程。mi RNA的调控特点在于其“一对多”的作用模式,即单个mi RNA可通过碱基不完全互补配对方式抑制多个基因表达。此种调控方式可引起细胞内大量分子相互作用关系和信号传导通路改变,因此,mi RNA被认为是调控细胞生物学行为的关键分子之一。micro RNA-7(mi R-7)于2001年首次在果蝇中被发现。2008年以来,mi R-7在肿瘤中的作用被陆续报道,称其在肝癌、肺癌和乳腺癌中表达降低,发挥抑癌基因的作用;近年来,亦有报道指出mi R-7可促进肾癌的发生。可见,mi R-7在肿瘤中的功能与机制仍不明确。本实验室前期通过比对高、低转移胃癌细胞系的mi RNA表达谱,发现mi R-7在高转移细胞系中表达量显著降低,提示其可能在胃癌发生和发展过程中发挥抑癌基因的作用。基于文献报道和前期研究结果,本研究将进一步聚焦mi R-7,为阐明其在胃癌恶性生物学行为中发挥的关键功能和调控机制提供理论和实验依据。【目的】1.明确mi R-7与胃癌发生发展的相关性。2.明确mi R-7在调控胃癌恶性生物学行为中所发挥的功能。3.揭示mi R-7在胃癌中发挥功能的分子生物学机制。4.揭示mi R-7在胃癌中表达失调的原因。【方法】1.利用实时定量PCR方法检测胃上皮细胞和胃癌细胞、胃癌新鲜组织标本及其匹配的癌旁正常组织中mi R-7的表达差异;利用原位杂交(ISH)技术检测胃癌组织芯片中mi R-7的表达水平,并统计分析其与胃癌病理参数间的相关性。2.合成mi R-7的模拟物和抑制物,并构建mi R-7的过表达和sh RNA干扰载体,分别通过瞬时转染和稳定感染,建立mi R-7的功能获得与功能缺失细胞模型;分别通过细胞生长曲线、平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验、裸鼠移植瘤实验和裸鼠转移瘤实验等方法,研究上、下调mi R-7对胃癌细胞增殖、凋亡和转移等恶性生物学行为的影响。3.联合运用c DNA基因芯片技术和蛋白组学i TRAQ技术,分别在胃癌细胞的转录组和蛋白质组两个层次,高通量筛选过表达mi R-7后的差异表达基因,并结合生物信息学方法,筛选差异表达基因中的mi R-7直接作用靶分子;采用双萤光素酶报告基因系统,验证mi R-7与候选靶分子间的相互作用关系;在胃癌细胞中上调或下调mi R-7后,利用蛋白印迹(Western blot)和实时定量PCR方法分别检测候选靶分子的表达变化;通过功能实验和功能挽救实验,分别验证mi R-7的靶分子在胃癌恶性生物学行为中所发挥的功能以及mi R-7通过调控这一靶分子对胃癌恶性生物学行为的影响。4.通过生物信息学方法,预测mi R-7启动子区域的转录因子结合位点;通过上调或下调这一转录因子,采用实时定量PCR方法检测mi R-7初始转录本(primary mi R-7,pri-mi R-7)的表达变化;利用染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验,在胃癌细胞中验证此转录因子与mi R-7启动子的结合情况;在胃癌细胞中上调或下调mi R-7,分别利用免疫荧光和实时定量PCR方法,检测mi R-7对此转录因子表达和定位,以及其下游效应分子表达的影响。【结果】1.实时定量PCR结果表明,与正常胃上皮细胞相比,mi R-7在胃癌细胞中表达降低,且在高转移胃癌细胞中表达进一步降低;与癌旁正常组织相比,mi R-7在胃癌组织中的表达降低,且在胃癌转移灶中的表达较原发灶进一步降低;组织芯片ISH结果表明,mi R-7在大多数胃癌临床标本中呈低表达,其表达水平与胃癌分级和分期呈负相关,与胃癌患者生存期呈正相关,并可作为判断胃癌预后的独立危险因素。2.实时定量PCR结果表明,通过转染和感染mi R-7的模拟物和抑制物,以及mi R-7的过表达载体和sh RNA干扰载体,能够有效上、下调mi R-7在胃癌细胞中的表达水平;细胞生长曲线、平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验表明,mi R-7能够抑制胃癌细胞的体外生长过程;通过流式细胞术检测细胞周期,结果表明mi R-7能够抑制胃癌细胞周期进展;通过流式细胞技术检测细胞凋亡,结果表明mi R-7能够促进胃癌细胞早期凋亡;Transwell迁移与侵袭实验结果表明,mi R-7能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力;裸鼠移植瘤实验结果表明,mi R-7能够抑制胃癌细胞的体内生长过程;裸鼠转移瘤实验结果表明,mi R-7能够抑制胃癌细胞形成转移灶的能力。3.在胃癌细胞中瞬时转染mi R-7后,联合运用c DNA基因芯片、i TRAQ技术和生物信息学方法,在全基因组的m RNA和蛋白水平高通量筛选出下调的差异表达基因分别为180个和75个,其中重点关注mi R-7对RELA、FOS和IGF1R等与肿瘤增殖和转移表型密切相关基因的调控;双萤光素酶报告基因实验结果表明,mi R-7能够直接结合RELA、FOS和IGF1R的3’末端非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)上的结合位点;实时定量PCR和Western blot结果表明,mi R-7与RELA和FOS的m RNA和蛋白表达均呈负相关,但其与IGF1R的负相关关系仅存在于蛋白水平;通过上调或下调RELA和FOS的功能实验结果表明,RELA和FOS能够促进胃癌细胞增殖,抑制胃癌细胞凋亡;功能挽救实验结果表明,mi R-7能够通过调控RELA和FOS抑制胃癌增殖;进一步机制研究表明,mi R-7可通过负向调控IKKε抑制RELA的激活;通过上调或下调IGF1R的功能实验结果表明,IGF1R能够促进胃癌细胞侵袭和转移;功能挽救实验结果表明,mi R-7能够通过调控IGF1R抑制胃癌侵袭和转移;进一步机制研究表明,mi R-7可通过抑制IGF1R,降低Snail的表达,间接促进E-cadherin的表达,抑制胃癌细胞的上皮-间质转化(EMT)过程。4.实时定量PCR结果表明,在胃上皮细胞中过表达IKKε和RELA可抑制pri-mi R-7的表达,在胃癌细胞系中干扰IKKε和RELA可促进pri-mi R-7的表达;通过生物信息学方法,预测到人类基因组中mi R-7的3个编码基因的启动子区域共存在7簇NF-κB的结合位点;Ch IP实验结果表明,RELA能够与mi R-7-1和-2基因的启动子区域相结合;免疫荧光结果表明,过表达mi R-7可抑制IKKε和RELA的表达,并能够抑制RELA的核转位;实时定量PCR结果表明,过表达mi R-7可抑制NF-κB信号通路下游多个效应分子的表达;启动子报告基因和实时定量PCR结果表明,幽门螺杆菌感染能够上调NF-κB转录活性,并抑制pri-mi R-7的表达。【结论】本研究明确了mi R-7在胃癌细胞和组织中的表达模式,揭示了mi R-7表达降低与胃癌的发生发展相关性;明确了mi R-7在调控胃癌恶性生物学行为中所发挥的功能,表明其在胃癌中起到抑制细胞增殖、促进凋亡和抑制转移的作用;揭示了mi R-7/IKKε/RELA和mi R-7/IGF1R/Snail两条分子通路分别影响胃癌增殖和转移表型的分子机制;揭示幽门螺杆菌感染导致NF-κB分子通路过度激活对mi R-7在胃癌中表达降低的重要影响。本研究为认识mi R-7在胃癌恶性生物学表型中发挥的关键功能与调控机制提供了理论基础,并使得mi R-7有望成为胃癌临床治疗行之有效且机制确凿的新靶点。
【关键词】：胃癌 mi R-7 增殖 转移
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 前言18-19
• 文献回顾19-31
• 第一部分 miR-7 在胃癌细胞和胃癌组织中的表达模式及其临床意义31-41
• 1 材料31-33
• 1.1 细胞系31
• 1.2 组织标本31-32
• 1.3 主要试剂32
• 1.4 主要仪器32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 细胞培养33
• 2.2 细胞和组织总RNA的提取33
• 2.3 实时定量PCR检测细胞和组织中miR-7 的表达33-34
• 2.4 组织原位杂交检测组织芯片中miR-7 的表达34-36
• 3 结果36-39
• 3.1 miR-7 在胃癌细胞和胃癌组织中的表达模式36-37
• 3.2 miR-7 表达与胃癌分级、分期的相关性37-39
• 4 讨论39-41
• 第二部分 miR-7 在胃癌细胞恶性生物学行为中的功能研究41-54
• 1 材料41-42
• 1.1 载体41
• 1.2 细胞系41
• 1.3 实验动物41
• 1.4 主要试剂41-42
• 1.5 主要仪器42
• 2 方法42-46
• 2.1 构建miR-7 功能获得和功能缺失细胞模型42-43
• 2.2 过表达或沉默miR-7 后的体外功能实验43-45
• 2.3 过表达或沉默miR-7 后的体外功能实验45-46
• 3 结果46-51
• 3.1 构建miR-7 功能获得和功能缺失细胞模型46-47
• 3.2 miR-7 抑制胃癌细胞体外增殖、促进凋亡和逆转耐药47-49
• 3.3 miR-7 抑制胃癌细胞迁移和侵袭49-50
• 3.4 miR-7 抑制胃癌细胞体内生长和转移50-51
• 4 讨论51-54
• 第三部分 miR-7 靶分子的高通量筛选与鉴定54-67
• 1 材料54-55
• 1.1 细胞系54
• 1.2 载体54
• 1.3 基因芯片54
• 1.4 主要试剂54-55
• 1.5 主要仪器55
• 2 方法55-60
• 2.0 瞬时转染构建miR-7 过表达模型55-56
• 2.1 iTRAQ技术高通量筛选miR-7 过表达后的差异表达蛋白56
• 2.2 cDNA基因芯片高通量筛选mi R-7 过表达后的差异表达基因56-57
• 2.4 iTRAQ与基因芯片高通量筛选结果的数据分析57
• 2.5 双萤光素酶报告基因实验验证miR-7 对靶分子的结合57-59
• 2.6 实时定量PCR检测细胞中RELA、FOS和IGF1R的表达59
• 2.7 Western blot检测细胞中RELA、FOS和IGF1R的表达59-60
• 3 结果60-63
• 3.1 联合转录组学、蛋白质组学和生物信息学方法筛选miR-7 的靶分子60-61
• 3.2 RELA、FOS和IGF1R是miR-7 的直接靶分子61-62
• 3.3 miR-7 负性调控RELA、FOS和IGF1R的表达62-63
• 4 讨论63-67
• 第四部分miR-7 调控胃癌发生的机制研究67-86
• 1 材料67-68
• 1.1 载体67
• 1.2 细胞系67
• 1.3 组织芯片67
• 1.4 实验动物67
• 1.5 主要试剂67-68
• 1.6 主要仪器68
• 2 方法68-71
• 2.1 过表达或沉默RLEA和FOS对胃癌细胞增殖能力的影响68-69
• 2.2 萤光素酶报告基因系统检测miR-7 对IKKε 的直接调控作用69
• 2.3 Ch IP验证RELA与miR-7 启动子区域的结合69-70
• 2.4 miR-7 对胃癌细胞中NF-κB信号通路的影响70
• 2.5 幽门螺杆菌感染对miR-7 生成的影响70-71
• 2.6 IHC检测胃癌组织芯片中RELA和FOS的表达71
• 3 结果71-81
• 3.1 miR-7 通过调控RELA和FOS抑制胃癌增殖71-74
• 3.2 miR-7 与NF-κB构成双负反馈调控环路74-80
• 3.3 miR-7 与RELA及FOS在胃癌组织中表达水平呈负相关80-81
• 4 讨论81-86
• 第五部分miR-7 调控胃癌转移的机制研究86-98
• 1 材料86-87
• 1.1 载体86
• 1.2 细胞系86
• 1.3 实验动物86
• 1.4 组织芯片86
• 1.5 主要试剂86-87
• 1.6 主要仪器87
• 2 方法87-88
• 2.1 过表达或沉默IGF1R对胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力的影响87-88
• 2.2 实时定量PCR检测E-cadherin上游转录抑制因子的表达88
• 2.3 miR-7 对胃癌细胞EMT相关标志物表达的影响88
• 2.4 IHC检测胃癌组织芯片中IGF1R的表达88
• 3 结果88-95
• 3.1 miR-7 通过调控IGF1R抑制胃癌细胞侵袭和转移88-92
• 3.2 miR-7 抑制胃癌细胞EMT92
• 3.3 miR-7 通过抑制IGF1R/Snail分子通路促进E-cadherin表达92-93
• 3.4 miR-7 与IGF1R在胃癌组织中表达水平呈负相关93-95
• 4 讨论95-98
• 小结98-99
• 参考文献99-108
• 附录108-121
• 个人简历和研究成果121-123
• 致谢123

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本文编号：1077903