腺苷A2A受体激动剂及小白菊内酯在实验性自身免疫性神经炎中的免疫调节作用的研究

发布时间：2017-12-10 13:11

  本文关键词：腺苷A2A受体激动剂及小白菊内酯在实验性自身免疫性神经炎中的免疫调节作用的研究

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【摘要】：研究背景:吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)累及周围神经,是一组急性炎性周围神经病,特征表现为急性起病,双侧肢体对称性、上行性、弛缓性瘫痪,可伴有或不伴有感觉障碍。周围神经病理检查可见炎性细胞浸润、脱髓鞘及轴索变性。GBS的发病机制尚不明确,无特异的有效的治疗药物,目前主要的治疗措施为血浆置换(plasma exchange,PE)及静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin injection,IVIG)。血浆置换及IVIG价格较贵,血浆置换使用条件高,免疫球蛋白为血液制品来源有限,限制了临床应用。因此有待我们探索GBS的发病机制及新的治疗方案。腺苷是体内正常的代谢产物,胞外的腺苷水平在病理条件下迅速升高。目前发现的腺苷受体有四型,A1受体、A2A受体、A2B受体及A3受体。A2A受体为G蛋白偶联受体。A2A受体激活后,能够抑制中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及树突状细胞产生细胞因子,抑制类风湿性关节炎、缺血再灌注损伤动物模型的炎症反应,发挥保护作用。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是GBS的动物模型,广泛用于GBS发病机制的探究及筛选新的治疗方案。尽管A2A受体激活的抗炎作用在多个研究中证实,但是在EAN中的作用目前尚无报道。研究目的:探究A2A受体激活对EAN的免疫调节作用。研究方法:1.EAN动物模型的诱导及症状观察用提取分离的来自牛马尾的牛周围神经髓鞘(bovine peripheral myelin,BPM)免疫Lewis大鼠,免疫后每天观察大鼠的肢体活动并称重,并对大鼠病情评分。评分标准:0=未发病;1=尾瘫;2=中度后肢瘫;3 =严重后肢瘫;4 =四肢瘫;5 =死亡。2.EAN动物模型的分组及干预将EAN模型随机分为2组:治疗组和对照组。于免疫后的第5天开始给予腹腔注射A2A受体激动剂CGS21680(lmg/kg)或者相同体积的生理盐水。EAN模型每天给药一次。在免疫后的第17天,处死大鼠,获取血清、坐骨神经及腹股沟淋巴结。3.流式细胞术检测淋巴结单个核细胞的细胞因子分泌、膜表面分子表达及淋巴细胞亚型研磨腹股沟淋巴结获取单个核细胞悬液,分别用荧光素标记的CD3、CD4、CD8、CD161a、CD80、CD86、CD103、CD19、γδTCR抗体标记细胞膜表面分子,用荧光素标记的IL-10、IL-4、IL-17A、TNF-α、IFN-γ抗体标记胞内细胞因子,CD4和Foxp3抗体标记调节性T细胞(regulatory T cells,Treg),CD4和CXCR5抗体标记滤泡辅助性T细胞(follicularhelperTcells,Tfh),用流式细胞仪上机检测。4.流式细胞术检测细胞增殖淋巴结单个核细胞预先用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)染色,后在 ConA 或者 P0 肽段(180-199)的刺激下培养增殖,3天后收集细胞,用流式细胞仪检测细胞增殖。5.ELISA检测细胞增殖上清中IL-2水平淋巴结单个核细胞在P0肽段(180-199)的刺激下培养增殖,3天后收集培养上清,用大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒检测上清中IL-2水平。6.ELISA检测血清中抗体IgG及IgG亚型水平用P0肽段(180-199)包被96孔板,ELISA方法检测大鼠心脏血血清中的特异抗体IgG及抗体亚型IgG1、IgG2a、IgG2b的水平。7.组织切片检测周围神经炎性细胞浸润及脱髓鞘大鼠坐骨神经用多聚甲醛固定脱水包被后,制作石蜡切片,HE染色检测神经组织炎性细胞浸润,用CD68抗体标记巨噬细胞,免疫组化染色检测巨噬细胞浸润,Luxol fast blue染色检测周围神经髓鞘脱失情况。8.统计学分析用GraphPad Prism 6软件对实验数据分析,临床评分采用秩和检验分析,其他数据采用t检验分析,设定p0.05为具有统计学差异。研究结果:1.A2A受体激动剂CGS21680促进EAN发病与对照组相比,CGS21680干预的大鼠发早、病情重、恢复晚、体重下降明显,临床评分在免疫后的第11、13和14天有统计学差异,体重在免疫后的第10、12、13、14天有统计学差异。2.A2A受体激动剂CGS21680促进坐骨神经炎性细胞浸润及脱髓鞘坐骨神经切片染色显示,与对照组相比,CGS21680干预组的浸润的巨噬细胞更多,脱髓鞘程度更明显。3.A2A受体激动剂CGS21680干预升高血清中抗P0肽段抗体ELISA检测显示,CGS21680干预的大鼠血清中的抗PO肽段抗体IgG、IgG1和IgG2a的水平高于对照组。4.A2A受体激动剂CGS21680抑制Th1和Th17细胞因子的产生,抑制体外淋巴细胞的增殖及IL-2的产生流式细胞术检测细胞因子显示CGS21680干预组的IFN-γ、TNF-α及IL-17的表达较对照组低,干预组的淋巴细胞增殖及IL-2的产生显著低于对照组。5.A2A受体激动剂CGS21680干预后减少了 Treg细胞,增加了 Tfh细胞、B细胞和树突状细胞与对照组相比,流式细胞术分析显示CGS21680干预后,引流淋巴结中的Treg细胞比例减少,Tfh细胞、B细胞和树突状细胞比例增加。6.A2A受体激动剂CGS21680促进CD86和MHC的表达流式细胞术分析结果显示,CGS21680干预后,表达CD86和MHCⅡ细胞的比例及平均荧光强度都高于对照组。结论:A2A受体激活可加重EAN病情。A2A受体激动剂CGS21680促进周围神经炎性细胞浸润和脱髓鞘。A2A受体激动剂CGS21680抑制Th1和Th17细胞,同时也减少了 Treg细胞,增加了 Tfh细胞和B细胞,促进了自身抗体的产生。研究背景:小白菊内酯(Parthenolide,PAR)是从植物小白菊中提取的倍半萜内酯,研究表明PAR具备强的抗炎活性。体外实验显示PAR能够抑制T细胞的增值,抑制T细胞和巨噬细胞产生促炎细胞因子。PAR的抗炎活性主要归结于对NF-κκB信号通路的抑制,PAR能够干扰NF-κB信号通路上的多个分子,因此,PAR也经常作为NF-κB的抑制剂来应用。NK-κB是一种进化保守的转录因子,最初在B细胞中发现,结合于κ链基因附近,因此得名为 NF-κB(nuclear factor binding near the κ light-chain gene in B cells)。后续研究发现NF-κB几乎表达于哺乳动物的所有细胞中,参与细胞的增值、分化、迁移及存活。NF-κB在免疫反应中有重要作用,感染、应激、细胞因子等多种刺激均会诱导NF-κB的激活。在多发硬化患者及多发硬化动物模型-实验性自身免疫性脑炎(experimental autoimmune encephalitis,EAE)-的脑组织均可检测到NF-κB的激活。在吉兰-巴雷综合征的动物模型-实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)的坐骨神经中,也检测到了 NF-κB信号通路的激活。此外,也有报道显示PAR能够直接抑制caspase-1的活性,抑制炎性小体的激活,进而抑制IL-1释放。PAR抗炎作用在类风湿关节炎、结肠炎、动脉粥样硬化和脑梗死的动物模型中都得到证实,但是PAR在神经系统的自身免疫疾病中的作用尚无报道。研究目的:探究PAR对EAN中的免疫调节作用。研究方法:1.EAN动物模型的诱导及症状观察用提取分离的来自牛马尾的牛周围神经髓鞘(bovine peripheral myelin,BPM)免疫Lewis大鼠,免疫后每天观察大鼠的肢体活动并称重,并对大鼠病情评分。评分标准:0 =未发病;1=尾瘫;2 =共济失调或者轻度后肢瘫;3 =中度后肢瘫;4 =严重后肢瘫;5 =四肢瘫;6 =濒死;7 =死亡。2.EAN动物模型的分组及干预将EAN模型随机分为3组:对照组、小剂量治疗组的大剂量治疗组。于免疫后的第5天开始给予腹腔注射PAR(小剂量组为2mg/kg,大剂量组为8mg/kg),对照腹腔注射相同体积的溶剂。EAN模型每天给药一次。分别于在免疫后的第10天和第14天,各处死一批大鼠,获取心脏血血清、坐骨神经及腹股沟淋巴结。3.流式细胞术检测细胞因子表达及CD4+T细胞亚群研磨腹股沟淋巴结获取单个核细胞悬液,用荧光素偶联的抗体标记后,流式细胞术检测胞内 TNF-α、IFN-γ、IL-17 的产生,检测 Th1(CD4+IFN+),Th17(CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)的比例。4.流式细胞术检测细胞凋亡淋巴结单个核细胞用凋亡试剂盒染色后,流式细胞术检测凋亡细胞比例。5.ELISA检测血清中IL-1β水平大鼠血清中IL-1β的水平用大鼠IL-1β检测试剂盒检测。6.坐骨神经切片染色大鼠坐骨神经固定脱水包埋后,制成石蜡切片,HE染色后观察炎性细胞浸润情况。7.体外淋巴细胞增殖实验获取免疫后第8天的大鼠的腹股沟淋巴结的单个核细胞,CFSE染色后,在体外分别用ConA和BPM刺激增殖,同时加入不同浓度的PAR,3天后收集细胞和培养上清。用流式细胞仪检测细胞增殖,上清中的IL-17A和TNF-α水平用ELISA检测。8.统计学分析用GraphPad Prism 6软件对实验数据分析,临床评分采用秩和检验分析,其他数据采用ANOVA检验分析,设定p0.05为具有统计学差异。研究结果:1.在体外PAR抑制淋巴细胞增值和细胞因子的产生体外细胞增殖实验显示,PAR能够显著抑制淋巴细胞的特异性及非特异性的细胞增值,并且显著抑制细胞产生IL-17和TNF-α,该抑制作用与PAR浓度成正相关。2.PAR在早期抑制EAN的诱导发病,在晚期妨碍EAN的恢复EAN的早起诱导阶段,免疫后的第11、12、13天,大剂量治疗组的临床评分较对照组低,小剂量组与对照组无显著差异;在疾病高峰即免疫后第14天后,大剂量组与对照组无显著差异,第16、17和18天,小剂量组的临床评分较对照组高。3.在 EAN 早期,PAR 抑制 TNF-α、IFN-γ、IL-17 和 IL-1β 的产生,减少 Th1 和 Th17细胞的比例免疫后的第10天,流式细胞术和ELISA检测结果显示,大剂量的PAR能够抑制促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17和IL-1β的产生,减少Th1和Th17细胞的比例,对Treg细胞无显著影响。小剂量PAR抑制IL-1β的产生,但是对其他细胞因子和T细胞亚群无显著影响。4.在EAN晚期,PAR对细胞因子产生和T细胞亚群无影响免疫后的第14天,再次检测上述指标,结果显示三组之间无明显差异。5.在EAN晚期,PAR抑制MNCs的凋亡和Fas的表达免疫后的第10天和第14天,分别检测淋巴结MNCs的凋亡和Fas、FasL的表达,结果显示在早期三组无差异,在晚期大剂量和小剂量PAR都能够抑制MNCs凋亡和Fas的表达。6.PAR对外周神经炎性细胞的浸润无明显作用坐骨神经的组织切片染色观察显示,三组都有大量的炎性细胞浸润。结论:体外实验结果显示PAR强的抗炎作用,但是EAN体内实验显示,PAR抑制早期EAN的诱导,在晚期妨碍EAN病情的恢复,PAR不适于神经系统自身免疫疾病的治疗。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R745.43

【参考文献】

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1 ;Parthenolide attenuates LPS-induced activation of NF-κB in a time-dependent manner in rat myocardium[J];Journal of Biomedical Research;2012年01期

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本文编号：1274555