华蟾毒精、土木香内酯诱导人结肠癌细胞凋亡及其机制的研究

发布时间：2017-12-10 15:10

  本文关键词：华蟾毒精、土木香内酯诱导人结肠癌细胞凋亡及其机制的研究

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【摘要】：结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。在美国,结直肠癌的发病率占所有癌症的第四位,死亡率占第二位。不同于西方一些国家结直肠癌的发病率和死亡率逐步降低,我国人群结直肠癌的发病率逐年升高并呈显年轻化趋势。因此研发高效低毒的抗癌新药是降低结直肠癌死亡率的关键。近年来,分子靶向药物成为治疗癌症的有效手段,与传统放化疗相比,分子靶向治疗优势明显。分子靶向药物针对性地靶向肿瘤细胞,对正常组织影响小,可减轻毒副反应、提高治疗效率。目前,虽然靶向药物的研究取得了一定的进展,但同时也遇到很多困难,例如由于细胞内的信号传导实际为多靶点、多环节的调控过程,单靶点药物只针对某一条细胞通路,肿瘤细胞最终会发生耐药,导致肿瘤复发、转移。因此,寻找有效的肿瘤特异性靶点并研发新药,特别是具有多靶点、多作用机理的抗肿瘤药物可能成为攻克癌症的有效途径。肿瘤细胞的新陈代谢速率高于正常细胞,因而承受着更大的氧化应激压力。在肿瘤发展过程中,细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平明显上升。ROS可引起上百种类型的DNA氧化损伤,其中氧化核苷酸池中或DNA单链中的脱氧三磷酸鸟苷(d GTP)及脱氧三磷酸腺苷(d ATP)生成8-羟基脱氧三磷酸鸟苷(8-oxoguanine,8-oxo G)及2-羟基-2-脱氧三磷酸腺苷(2-OH-d ATP)是最常见的DNA氧化修饰,二者插入DNA中后进行的碱基切除修复和错配修复可导致DNA单链大量缺口和断裂,继而引起DNA双链断裂、DNA损伤、细胞凋亡。肿瘤细胞为解决自身高水平ROS,研究发现多种肿瘤细胞均高表达一种核苷酸焦磷酸酶——MTH1(mut T homolog 1),其表达量与肿瘤的恶性程度正相关。MTH1蛋白是Mut T同源酶,分布于细胞的线粒体和细胞核中,参与DNA损伤修复过程。MTH1能够高效水解8-oxo G及2-OH-d ATP,从而防止氧化的核苷酸掺入DNA双链。研究发现,肿瘤细胞内的MTH1充当了氧化核苷酸“清洁工”的作用,是维持肿瘤细胞生存、促进肿瘤发展所必须的,利用si RNA干扰MTH1正常功能后肿瘤细胞DNA受损、细胞凋亡。值得注意的是,正常细胞的存活并不依赖于MTH1的作用,敲除MTH1对正常细胞无影响。基于以上研究结果,我们可以得出以下推论:升高肿瘤细胞ROS水平或者靶向抑制MTH1酶活性均可以使肿瘤细胞的氧化应激增大,插入DNA中的氧化核苷酸增多,造成DNA损伤、肿瘤细胞凋亡。中药抗肿瘤具有悠久历史,但多数中药成分复杂,包含无效成分甚至有毒成分,因而提取其有效成分并进一步加以分离、纯化得到有效单体是中药研究领域的一项重要内容。在中药单体中筛选具有抗癌作用的先导化合物并对其进行结构修饰和剂型改造也是抗癌新药研发的重要手段。基于以上理论和研究成果,我们制定了本研究的技术路线:首先,应用体外高通量酶学实验在中药单体库中筛选具有抑制MTH1酶活性的单体;之后选取人结肠癌细胞作为研究模型,在细胞水平验证所筛选出的中药单体通过抑制MTH1,使肿瘤细胞内大量8-oxo G累积、DNA损伤、结肠癌细胞凋亡;最后,利用计算机模拟分子对接技术进一步证明所选单体与MTH1的结合。在本研究中,我们通过对175种中药单体进行酶学筛选,发现华蟾毒精具有很好的MTH1抑制作用,其酶学反应半抑制浓度IC50为11.51μm。在细胞实验中,我们发现华蟾毒精可抑制人结肠癌细胞SW480的增殖、诱导细胞凋亡。用相同剂量的华蟾毒精处理结肠癌细胞和人正常细胞,结果显示华蟾毒精对SW480细胞具有明显的杀伤作用而对正常细胞无影响。华蟾毒精引起SW480细胞周期G1/G0期阻滞,WB检测p21Cip/WAF1表达升高。免疫荧光检测及单细胞凝胶电泳实验证明华蟾毒精处理后的SW480细胞8-oxo G含量显著升高,DNA损伤标志物53BP-1蛋白表达量增加。接下来我们检测了华蟾毒精对SW480细胞的线粒体膜电位以及细胞内ROS水平的影响,结果显示华蟾毒精可引起线粒体膜电位降低、ROS升高。综合以上实验结果我们得出结论:华蟾毒精通过靶向抑制MTH1活性和升高细胞ROS水平的双重抗肿瘤作用机制引起结肠癌细胞凋亡。为进一步证明华蟾毒精与MTH1的结合,我们应用计算机模拟分子对接技术对MTH1与华蟾毒精进行了分子对接,结果显示二者通过氢键和Pi-Pi共轭作用形成稳定的复合物,且华蟾毒精结合在MTH1的催化位点处。接下来,我们应用计算机模拟技术对华蟾毒精的药代动力学、药效学及毒理学性质进行预测和分析,发现华蟾毒精具有较好的成药性。在酶学筛选实验中我们发现土木香内酯虽不具备MTH1抑制作用,但亦能引起SW480细胞内8-oxo G增多、DNA损伤。进一步实验结果表明土木香内酯可诱导结肠癌细胞凋亡、细胞周期阻滞在G1/G0期、p21Cip/WAF1蛋白表达量升高,但对人正常细胞无影响;土木香内酯可引起SW480细胞线粒体膜电位降低、ROS水平升高;土木香内酯处理后的SW480细胞线粒体通路蛋白表达发生了变化,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低、促凋亡蛋白Bax以及活化的caspase-3表达量增多。实验结果表明:土木香内酯可升高SW480细胞ROS水平、通过内源性途径激活线粒体凋亡通路诱导SW480细胞凋亡。本文对华蟾毒精和土木香内酯诱导人结肠癌细胞凋亡的分子机制进行了深入研究,发现华蟾毒精作为靶向MTH1抑制剂的同时兼有升高ROS的作用。对比只有升高ROS作用的土木香内酯对SW480细胞的IC50为21.63μM,华蟾毒精的IC50极低,仅为110.3n M,二者相差约200倍。计算机模拟研究证明华蟾毒精结合于MTH1的催化位点,并预测其具有较好的成药性。综上所述,华蟾毒精和土木香内酯均能够抑制人结肠癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡,是两种可进一步研发的抗癌药物,本研究为其成药研究及临床应用提供了技术方法和理论基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.3

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本文编号：1274909