B-Myb对结肠癌细胞增殖和侵袭转移的影响及其分子机制研究

发布时间：2017-12-13 07:36

  本文关键词：B-Myb对结肠癌细胞增殖和侵袭转移的影响及其分子机制研究

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【摘要】：B-Myb是转录因子Myb基因家族的成员之一,位于染色体20q13,广泛分布于具有增殖能力的细胞中。通过对体外培养的细胞进行检测,B-Myb在细胞周期的S-期表达量最高,而且B-Myb表达量的改变影响细胞周期的进程、凋亡、致癌作用及衰老。基因表达谱分析显示B-Myb在人的多种类型的恶性肿瘤中表达显著高于相同组织来源的正常组织。促进乳腺癌细胞的克隆形成、细胞周期进程及迁移侵袭,促进肝癌细胞的增殖及G1-S和G2-M期的转换等。这些研究表明B-Myb能够促进肿瘤的发生发展。目前,B-Myb在结肠癌发生发展中的作用及分子机制仍不清楚,故本论文主要研究B-Myb在结肠癌样本中的表达水平及对结肠癌细胞增殖、细胞周期、侵袭迁移、细胞凋亡及肿瘤形成等方面的影响及其分子机制。第一部分B-Myb在结肠癌样本中的表达分析目的:检测结肠癌组织和结肠正常组织及结肠癌不同细胞系中B-Myb表达水平,确认B-Myb与结肠癌临床病理特征是否具有关联。方法:应用qRT-PCR、Western blot及免疫组化技术检测结肠癌组织和结肠正常组织以及结肠癌不同细胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表达水平,统计分析B-Myb与病人的临床病理分级、病理分期、肿瘤大小和淋巴道转移之间的关系。结果:检测49例结肠cDNA芯片、结肠癌细胞系及120例结肠组织芯片中B-Myb的mRNA和蛋白表达水平。统计分析结果显示:结肠癌组织中B-Myb的mRNA表达水平显著高于结肠正常组织中的表达(p=0.002),其表达量与临床病理分期关系密切(p=0.005);进一步检测结肠癌的6个细胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表达水平,发现不同结肠癌细胞之间B-Myb表达量存在显著差异,其中以SW620细胞中B-Myb表达量最高,RKO细胞中B-Myb表达量最低;通过对结肠癌患者组织芯片进行免疫组化染色,B-Myb表达主要定位于细胞浆;统计分析结果显示:结肠癌组织中B-Myb的蛋白表达量显著高于结肠正常组织中的表达(p0.05),且表达量与临床分级(p0.05)及肿瘤的大小(p0.001)存在显著性差异。结论:结肠癌组织中B-Myb的mRNA表达水平显著高于结肠正常组织中的表达,其表达量与临床病理分期存在相关性;结肠癌的6个细胞系中B-Myb的mRNA和蛋白表达水平存在显著差异,其中以SW620细胞中B-Myb表达量最高,RKO细胞中B-Myb表达量最低;结肠癌患者B-Myb蛋白表达水平显著高于结肠正常组织中的表达,其表达量与临床分级及肿瘤的大小存在相关性。第二部分B-Myb在结肠癌发生发展过程中的作用目的:明确过表达或敲降B-Myb对结肠癌细胞HCT116、HT29、SW620增殖、周期、凋亡、克隆形成及侵袭迁移的影响;检测过表达或敲降B-Myb对结肠癌细胞HCT116在裸鼠体内成瘤的影响。方法:qRT-PCR和Western blot技术检测B-Myb在结肠癌细胞HCT116、HT29、SW620中表达情况。过表达或敲降B-Myb后,流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,免疫荧光技术检测DNA合成(S期)及有丝分裂(M期)的变化,划痕实验检测细胞的侧向迁移能力,transwell实验检测细胞的迁移侵袭能力,平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力,裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力。结果:qRT-PCR和Western blot结果提示,慢病毒感染的过表达和敲降B-Myb以及si RNA瞬时转染的细胞株构建成功。CCK8实验结果显示:从72 h到96 h,B-Myb稳定过表达HCT116和HT29细胞株的增殖能力均明显高于对照组(P0.001);从48 h到96 h,瞬时敲降B-Myb的HCT116、HT29及SW620细胞株的增殖能力显著低于对照组(P0.01,P0.01,P0.05);从72 h到96 h,稳定敲降B-Myb的HCT116和HT29细胞株的增殖能力均显著低于对照组(P0.01)。流式细胞仪检测结果显示:HCT116和HT29细胞B-Myb过表达组的G1期细胞数量均较对照组减少(p0.05),而S期细胞数均较对照组增加(p0.01),G2/M期细胞数均较对照组增加(p0.05);HCT116和SW620细胞B-Myb被小干扰RNA敲降后,S期细胞数量均较对照组明显减少(p0.05),G2/M期细胞数均较对照组明显增加(p0.001,p0.01);HCT116和HT29细胞B-Myb稳定敲降后,B-Myb稳定敲降组的G1期细胞数量均较对照组显著减少(p0.05,p0.001),HCT116的S期细胞数量较对照组显著减少(p0.05),两个细胞系中G2/M期细胞数量均较对照组显著增加(p0.001,p0.01)。免疫荧光实验结果显示:HCT116和HT29细胞B-Myb过表达组处于S期的细胞数量均显著高于对照组(p0.01,P0.001),处于M期的细胞数量也均显著高于对照组(p0.01,P0.001);稳定敲降B-Myb的HCT116细胞中,B-Myb敲降组处于S期的细胞数量显著低于对照组(p0.001),而在稳定敲降B-Myb的HT29细胞中,B-Myb敲降组处于S期的细胞数量高于对照组(p0.05),两个细胞系中,B-Myb敲降组处于M期的细胞数量均高于对照组(p0.01,p0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:HCT116和HT29细胞B-Myb过表达组细胞凋亡率均显著低于对照组细胞凋亡率;稳定敲降B-Myb的HCT116和HT29细胞组中细胞凋亡率均高于对照组细胞凋亡率。划痕实验结果显示:HCT116和HT29细胞中B-Myb过表达组细胞的侧向迁移能力均较对照组明显增加。HCT116、HT29、SW620三种结肠癌细胞B-Myb瞬时敲降或稳定敲降组细胞的侧向迁移能力均较对照组下降。Transwell实验结果显示:B-Myb稳定过表达的HCT116(迁移实验,P0.001;侵袭实验,P0.001)和HT29(迁移实验,P0.001;侵袭实验,P0.001)细胞穿到膜下方的数量显著多于对照组;si RNA干扰B-Myb的HCT116和HT29细胞迁移能力均显著低于对照组(P0.001,P0.01);B-Myb稳定敲降的HCT116(迁移实验,P0.001;侵袭实验,P0.001)和HT29(迁移实验,P0.05;侵袭实验,P0.001)细胞穿到膜下方的数量显著少于对照组。平板克隆实验结果显示:HCT116和HT29细胞B-Myb过表达组细胞的克隆团数量明显多于对照组(P0.01,P0.05);HCT116和HT29细胞B-Myb稳定敲降组细胞的克隆团数量均明显少于对照组(P0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示:HCT116细胞B-Myb稳定过表达组(n=3)肿瘤的生长明显快于对照组(n=3)(P0.05),瘤体的重量也显著高于对照组(P0.01);HCT116细胞B-Myb稳定敲降组(n=5)肿瘤的生长明显慢于对照组(n=5)(P0.05),瘤体重量也显著低于对照组(P0.001)。结论:B-Myb能够促进结肠癌细胞HCT116、HT29和SW620的增殖、G1/S期转换、细胞的侧向及正向迁移、细胞侵袭及克隆形成,抑制细胞凋亡,且B-Myb过表达促进结肠癌细胞HCT116的裸鼠体内肿瘤形成。第三部分B-Myb在结肠癌发生发展中的分子机制研究目的:探究B-Myb在结肠癌发生发展中的分子机制。方法:RNA-seq技术及GO数据分析、pathway数据分析筛选由B-Myb调控的下游靶基因及信号通路;qRT-PCR技术验证筛选的靶基因的mRNA表达情况;Western blot技术验证ERK信号通路;构建B-Myb删除体及点突变体,探究B-Myb的具体转录激活域。结果:稳定过表达B-Myb和敲降B-Myb的慢病毒感染结肠癌细胞株HCT116的总RNA进行RNA-seq检测,B-Myb稳定过表达组vs对照组中表达上调的基因与B-Myb稳定干扰组vs对照组中表达下调的基因形成交集的有1558个,B-Myb稳定过表达组vs对照组中表达下调的基因与B-Myb稳定干扰组vs对照组中表达上调的基因形成交集的有1962个,对两组交集的全部基因进行GO富集分析,结果显示:由B-Myb表达变化引起的差异表达的靶基因功能主要集中于信号转导、细胞生物学进程的调节、细胞增殖、细胞周期调控、细胞凋亡调控、细胞生长、细胞分化及调控细胞的运动能力。通过qRT-PCR技术对差异表达的靶基因E2F1、E2F2、E2F3、E2F8、ZNF473、ESCO2、KIF11、NRP1、WISP2、DLC1、KBTBD6、IGFBP3进行验证,结果与RNA-seq检测结果相符;pathway富集分析,结果显示:富集通路主要有MAPK信号通路、细胞因子间相互作用、癌症信号通路、Rap1信号通路以及Jak-STAT信号通路,通过Western blot技术检测证实:B-Myb过表达促进ERK及AKT的磷酸化,敲降B-Myb抑制ERK及AKT磷酸化;成功构建B-Myb删除体:B-Myb(aa 1-359)、B-Myb(aa 1-561)、B-Myb(aa 360-700),突变体:B-Myb(N174A)。瞬时转染于稳定敲降B-Myb的结肠癌细胞HCT116后,通过划痕实验检测删除体及突变体对细胞生长及迁移能力的影响,结果证实,B-Myb(aa 1-359)对稳定敲降B-Myb的HCT116细胞的侧向迁移能力没有明显影响,而B-Myb(aa1-561)、B-Myb(aa 360-700)及B-Myb(N174A)能够促进稳定敲降B-Myb的HCT116细胞侧向迁移能力。结论:B-Myb通过调节下游靶基因正向调节ERK及AKT信号通路在结肠癌细胞HCT116中发挥作用;B-Myb基因在结肠癌胞HCT116发生发展过程中所发挥的作用或许主要依赖于CR(aa 369-614)功能区。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35

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