D-Ala2-GIP-glu-PAL对MPTP诱导的急性和慢性帕金森病小鼠模型的神经保护作用

发布时间：2017-12-21 01:08

  本文关键词：D-Ala2-GIP-glu-PAL对MPTP诱导的急性和慢性帕金森病小鼠模型的神经保护作用　出处：《山西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:1.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL对MPTP诱导的急性和慢性帕金森病(Parkinson’s disease,PD)小鼠模型的PD样症状、黑质和纹状体多巴胺能神经元和神经纤维的丢失、α-突触核蛋白的表达增多等病理损害是否具有逆转作用。探讨D-Ala2-GIP-glu-PAL是否对PD小鼠模型具有神经保护作用。2.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能够抑制急性PD小鼠黑质的神经胶质细胞的激活,调节凋亡基因Bax和Bcl-2的表达,以及p-CREBS133的表达,来探讨D-Ala2-GIP-glu-PAL治疗急性PD小鼠模型的作用机制。3.研究D-Ala2-GIP-glu-PAL是否能够抑制慢性PD小鼠黑质和纹状体的神经胶质细胞的激活,抑制脂质过氧化反应,调节脑源性神经营养因子(Bain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达,来探讨D-Ala2-GIP-glu-PAL治疗慢性PD小鼠模型的作用机制。方法:1.急性PD模型1.1动物分组和给药:体重25 g左右的雄性C57BL/6小鼠32只,随机分为四组:对照组、D-Ala2-GIP-glu-PAL组、MPTP组(模型组)和MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL组(给药组),每组8只。模型组和给药组小鼠经腹腔注射MPTP(20 mg/kg体重),连续4次,每次间隔2小时,对照组和D-Ala2-GIP-glu-PAL组注射等量的生理盐水。在MPTP注射后的第2天,MPTP+D-Ala2-GIP-glu-PAL组小鼠经腹腔注射D-Ala2-GIP-glu-PAL(25nmol/kg体重),对照组和MPTP组给与等量的生理盐水,D-Ala2-GIP-glu-PAL组注射等量的D-Ala2-GIP-glu-PAL,连续7天。1.2行为学实验:在MPTP注射后的第5天进行爬杆实验,第6天进行旷场实验。1.3取材:所有小鼠于mptp注射后的第7天处死,每组4只取全脑固定后石蜡包埋切片用于免疫组织化学染色。每组其余4只取新鲜全脑分离出腹侧中脑(含黑质(snpc)),用于westernblot实验。1.4采用免疫组织化学染色法检测小鼠黑质和纹状体酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,th)的表达,黑质胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,gfap)和离子钙接头蛋白(ionizedcalcium-bindingadaptormolecule1,iba1)的表达。1.5采用westernblot实验检测小鼠黑质突触素(synaptophysin,syn)、bax、bcl-2、p-crebs133的表达。2.慢性pd模型2.1动物分组和给药:体重25g左右的雄性c57bl/6小鼠48只,随机分为四组:对照组、d-ala2-gip-glu-pal组、mptp+丙磺舒组(模型组)和mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal(给药组)组,每组12只。模型组和给药组小鼠经腹腔注射mptp(20mg/kg体重)和丙磺舒(250mg/kg体重),每3.5天重复注射一次,共注射10次,对照组和d-ala2-gip-glu-pal组注射等量的生理盐水。从mptp和丙磺舒注射后的第二天,给药组和d-ala2-gip-glu-pal组小鼠经腹腔注射d-ala2-gip-glu-pal(25nmol/kg体重),模型组和对照组给与等量的生理盐水,每天1次,连续6周。2.2行为学实验:在mptp和丙磺舒注射后的第6周进行旷场实验、爬杆实验和转棒实验。2.3取材:所有实验动物于第6周末处死,每组6只取新鲜全脑分离出腹侧中脑(含黑质)用于westernblot实验。每组其余6只取全脑固定后石蜡包埋切片用于免疫组织化学染色。2.4采用免疫组织化学染色法检测小鼠黑质和纹状体th、α-突触核蛋白、gfap、iba1、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-hne)的表达,以及黑质bdnf的表达。2.5采用westernblot实验检测小鼠黑质α-突触核蛋白和bdnf的表达。结果:1.急性pd模型1.1行为学实验结果:旷场实验的结果显示mptp组小鼠跨越格子的数目和后脚站立的次数均明显少于对照组(p0.01),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠跨越格子的数目和后脚站立的次数却明显多于mptp组(p0.05)。爬杆实验的结果显示mptp组小鼠的t-turn和t-la均明显多于对照组(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠的t-turn和t-la却明显少于mptp组(p0.01)。1.2免疫组化染色结果:mptp组snpc的th(+)神经元的数目降低到了对照组的27.00%(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组snpc的th(+)神经元的数目却明显高于mptp组(p0.05),为对照组的59.4%。mptp组纹状体的th(+)神经纤维的染色强度降低到了对照组的56.86%(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组纹状体的th(+)神经纤维的染色强度却明显高于mptp组(p0.01),为对照组的83.64%。mptp组黑质的gfap(+)细胞的面积百分比和iba1(+)细胞的面积百分比均明显大于对照组(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组黑质的gfap(+)细胞的面积百分比和iba1(+)细胞的面积百分比与mptp组比较均明显降低(p0.001)。1.3westernblot结果:mptp组黑质syn的表达明显低于对照组(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质syn的表达却明显高于mptp组(p0.01)。与对照组比较,mptp组黑质bax的表达略微升高,而bcl-2的表达明显降低,bax/bcl-2比值明显升高(p0.001)。mptp+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质bax的表达虽然与mptp组无明显差异,但bcl-2的表达明显升高,bax/bcl-2比值与mptp组比较明显降低(p0.01)。mptp组黑质p-crebs133的表达较对照组明显降低(p0.001),而mptp+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质p-crebs133的表达与mptp组比较略微升高(p0.05)。2.慢性pd模型2.1行为学实验结果:旷场实验的结果显示mptp+丙磺舒组小鼠跨越格子的数目和后脚站立的次数均明显少于对照组(p0.01),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠跨越格子的数目和后脚站立的次数却均明显多于mptp+丙磺舒组(p0.05)。爬杆实验的结果显示mptp+丙磺舒组小鼠的t-turn和t-la均明显多于对照组(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠的t-turn和t-la却均明显少于mptp+丙磺舒组(p0.05)。转棒实验的结果显示mptp+丙磺舒组小鼠的掉落潜伏期明显少于对照组(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠的掉落潜伏期却明显长于mptp+丙磺舒组(p0.05)。2.2免疫组化染色结果:mptp+丙磺舒组黑质的th(+)神经元的数目降低到了对照组的33.99%(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组黑质的th(+)神经元的数目却明显高于mptp+丙磺舒组(p0.05),为对照组的59.21%。mptp+丙磺舒组纹状体的th(+)神经纤维的染色强度降低到了对照组的56.75%(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组纹状体的th(+)神经纤维的染色强度却明显高于mptp+丙磺舒组(p0.01),为对照组的73.33%。mptp+丙磺舒组小鼠的黑质和纹状体α-突触核蛋白的染色明显强于对照组(p0.001),并且黑质存在大量α-突触核蛋白强阳性的神经元胞体。然而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组黑质和纹状体α-突触核蛋白的染色却明显弱于mptp+丙磺舒组(p0.05)。mptp+丙磺舒组黑质和纹状体的gfap(+)细胞的面积百分比和iba1(+)细胞的面积百分比均明显大于对照组(p0.001)。而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组黑质和纹状体的gfap(+)细胞的面积百分比和iba1(+)细胞的面积百分比与mptp+丙磺舒组比较均明显降低(p0.001)。mptp+丙磺舒组小鼠黑质和纹状体的4-hne染色强度均明显高于对照组(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质和纹状体的4-hne染色强度却明显低于mptp+丙磺舒组(p0.05)。mptp+丙磺舒组小鼠黑质的bdnf(+)细胞的面积明显低于对照组(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质bdnf(+)细胞的面积却明显高于mptp+丙磺舒组(p0.05)。2.3westernblot结果:mptp+丙磺舒组黑质α-突触核蛋白的表达明显高于对照组(p0.001),而mptp+丙磺舒+d-ala2-gip-glu-pal组小鼠黑质α-突触核蛋白的表达却明显低于mptp+丙磺舒组(p0.05)。mptp+丙磺舒组小鼠黑质的bdnf表达明显低于对照组(P0.001),而MPTP+丙磺舒+D-Ala2-GIP-glu-PAL组小鼠黑质BDNF的表达却明显高于MPTP+丙磺舒组(P0.05)。结论:1.D-Ala2-GIP-glu-PAL不仅改善了MPTP诱导的急性和慢性PD小鼠模型的运动症状,而且抑制了黑质和纹状体多巴胺能神经元及其纤维的丢失、α-突触核蛋白的表达增多等典型病理表现,发挥了神经保护作用。2.D-Ala2-GIP-glu-PAL发挥神经保护的作用机制可能与激活黑质多巴胺能神经元GIP-R信号传导通路,调节CREB介导的基因转录,促进BCL-2表达,抑制细胞凋亡,抑制脂质过氧化反应,促进BDNF的生成,抑制神经胶质细胞激活和神经炎症反应等有关。本课题为山西医科大学李琳教授与2015年山西省高校“131”领军人才、第二层次人才英国兰卡斯特大学Christian Holscher教授合作科研计划“the use of GIP analogues in diseases of loss of synaptic transmission”。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5;R-332

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