结直肠癌中CYP24A1异常表达的临床意义及调控机制的研究

发布时间：2017-12-21 23:22

  本文关键词：结直肠癌中CYP24A1异常表达的临床意义及调控机制的研究　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤,其发病率居全球恶性肿瘤第三位,每年约有136万新发病例,病死率居第四位,每年约有69万人死于结直肠癌。近年来,结直肠癌发病率在我国呈上升趋势,成为影响公众健康的重大疾病。流行病学及实验研究均表明,维生素D与结直肠癌的发病密切相关。维生素D可通过抗增殖,促分化,促凋亡,抑制血管生成,免疫调节等途径发挥抗结直肠癌的作用,维生素D及其代谢通路正成为结直肠癌防治研究领域中的热点。维生素D_3是维生素D最重要的形式,其活性代谢产物为1,25(OH)_2D_3。1,25(OH)_2D_3通过与VDR结合,调控多个基因表达,发挥抗肿瘤生物活性。CYP24A1是维生素D代谢过程中的限速酶,将25(OH)D_3,1,25(OH)_2D_3分别羟化为24,25(OH)_2D_3和1α,24,25(OH)_3D_3而失去生物学活性,在1,25(OH)_2D_3抗肿瘤作用中发挥至关重要的调节作用。研究表明,CYP24A1是一个潜在的癌基因,在乳腺癌、肺癌、食管癌等组织中异常表达且与肿瘤恶性程度及患者不良预后相关,在某些类型肿瘤中CYP24A1异常表达受DNA甲基化的调控。目前,国内外关于结直肠癌组织中CYP24A1及VDR表达情况的研究较少,CYP24A1及VDR的表达与结直肠癌患者临床病理学指标及预后之间的关联性尚不明确,DNA甲基化是否能够调控结直肠癌细胞中CYP24A1的表达也有待进一步阐明。基于此,本研究拟通过实验揭示在结直肠癌发病及进展过程中,VDR及CYP24A1表达与患者临床病理学信息及预后的相关性,以及其表达的变化对1,25(OH)_2D_3抗结直肠癌功能的影响,同时,对CYP24A1在结直肠癌中表达的调控机制进行探讨,阐明DNA甲基化在调控结直肠癌细胞CYP24A1表达中的作用。方法:(1)根据结直肠癌的自然演变过程,系统收集正常、癌前病变及癌组织,包括57例正常肠粘膜、12例肠腺瘤、99例肠癌组织,构建组织芯片,通过免疫组织化学技术检测VDR及CYP24A1表达水平的变化,探讨其与患者临床信息包括年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、血管浸润、神经浸润以及预后信息的关联性并进行统计分析;使用ELISA实验方法对40例健康体检者、12例腺瘤患者、46例结直肠癌患者的血清25(OH)D_3水平进行检测;(2)在肠癌细胞系SW480、Caco2中,通过WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒分别检测1,10,100,200n M四个剂量1,25(OH)_2D_3处理24h,48h,96h后,肿瘤细胞相对存活率的变化,通过RT-PCR检测100n M 1,25(OH)_2D_3处理SW480、Caco2细胞系后VDR,CYP24A1 mRNA表达水平的变化;在Caco2细胞系中通过RNAi技术对CYP24A1基因表达进行干涉,通过WST-1试剂盒检测干涉CYP24A1后1,25(OH)_2D_3对Caco2细胞增殖抑制作用的变化;(3)通过BSP实验检测5例结直肠癌组织及配对正常组织中CYP24A1启动子区甲基化水平的差异,并通过5-氮杂-2-脱氧胞苷对结直肠癌细胞系SW480、Caco2进行去甲基化处理,通过RT-PCR比较处理前后细胞中CYP24A1基因mRNA表达水平的改变,此外,对Caco2细胞进行去甲基化处理后,通过RT-PCR检测1,25(OH)_2D_3调控CYP24A1表达的变化,在组织和细胞层面研究DNA甲基化在CYP24A1基因表达中的调控作用。结果:(1)成功构建了结直肠癌组织芯片并与免疫组织化学技术相结合检测CYP24A1和VDR的表达。CYP24A1在肠癌、腺瘤、正常组织中的高表达率分别为69.7%、66.7%、21.1%,CYP24A1在肠癌组织中和腺瘤组织的表达均显著高于正常组织,而肠癌及腺瘤组织中的表达尚不存在差异;VDR在肠癌、腺瘤、正常组织中高表达率分别为27.3%、58.3%、64.9%,VDR在肠癌中的高表达率显著低于腺瘤组织和正常组织,腺瘤组织和正常组织中VDR的表达暂未发现差异。CYP24A1表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及血管浸润情况密切相关;VDR表达与肿瘤的浸润深度相关;(2)CYP24A1高表达组结直肠癌患者的总生存期及无病生存期显著低于低表达组,Cox比例风险回归模型显示,CYP24A1表达是结直肠癌无病生存期的独立影响因素(HR=2.829,95%CI=(1.092-7.330),P=0.032)。VDR高表达组结直肠癌患者的总生存期及无病生存期与低表达组结直肠癌患者的总生存期及无病生存期无显著性差异;(3)结直肠癌患者血清25(OH)D_3水平为非正态分布,其中位数为10.80ng/ml,四分位数间距为(4.58,28.21),腺瘤患者血清25(OH)D_3水平为63.29±32.95ng/ml,健康体检者血清25(OH)D_3水平为67.91±33.26ng/ml。结直肠癌患者血清25(OH)D_3水平明显低于健康对照组及腺瘤组,腺瘤组与健康对照组尚无差异。血清25(OH)D_3水平与CYP24A1的表达,在腺瘤患者中呈负相关(r=-0.614,P=0.034),在结直肠癌患者中暂无相关性。血清25(OH)D_3水平与VDR的表达,在结直肠癌及肠腺瘤患者中无相关性;(4)不同剂量1,25(OH)_2D_3作用于SW480细胞系、Caco2细胞系,在不同时间点观察其抑制细胞增殖作用,结果发现100n M 1,25(OH)_2D_3作用于SW480细胞系,在48h时间点开始出现抑制增殖的作用,随着作用时间的延长、剂量的增加,其抑制作用愈加明显,而在各时间点Caco2细胞系中均未发现其抑制细胞增殖作用。经检测,Caco2细胞系中CYP24A1表达显著高于SW480细胞系,在Caco2细胞系中干涉CYP24A1的表达后,结果发现100n M 1,25(OH)_2D_3作用于Caco2细胞系,在48h时间点出现抑制增殖的作用,细胞相对存活率变为对照组的76.23%,与对照组相比具有统计学差异;(5)CYP24A1 mRNA表达与其启动子区甲基化水平在正常肠粘膜组织和结直肠癌组织中无相关性(r=-0.483,P=0.226);在Caco2细胞系中,使用不同剂量DAC进行去甲基化处理后,各组细胞与对照组比较,CYP24A1 mRNA表达均增高,差异具有统计学意义,而在SW480细胞系中未观察到此作用。在Caco2细胞系中,经DAC去甲基化处理后1,25(OH)_2D_3诱导CYP24A1表达增高的程度高于未经DAC处理组,差异具有统计学意义。结论:(1)CYP24A1在肠癌及腺瘤组织中表达升高,VDR在肠癌组织中的表达量低于腺瘤组织以及正常组织;CYP24A1高表达率在T3-T4期高于Tis-T2期,在淋巴结转移组高于未转移组,血管浸润组高于未发生浸润组。VDR高表达率在Tis-T2期高于T3-T4期。(2)CYP24A1高表达与结直肠癌患者不良预后相关,CYP24A1高表达者总生存期及无病生存期低于低表达者,Cox比例风险回归模型显示,CYP24A1是无病生存期的独立影响因素。(3)结直肠癌患者血清25(OH)D_3水平低于健康人群和腺瘤患者,在腺瘤患者中,CYP24A1的表达与血清25(OH)D_3水平呈负相关。(4)肠癌细胞中CYP24A1表达上调会影响1,25(OH)_2D_3的抗肿瘤活性,在Caco2细胞系中,抑制CYP24A1的表达将增强1,25(OH)_2D_3的抗肿瘤活性。(5)结直肠癌组织中CYP24A1 mRNA表达与CYP24A1启动子区甲基化水平无相关性。但在特定细胞系中,DNA甲基化参与了CYP24A1表达的调控。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

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本文编号：1317536