胆碱激酶α促进肝细胞癌进展及药物抵抗的机制研究

发布时间：2017-12-21 23:35

  本文关键词：胆碱激酶α促进肝细胞癌进展及药物抵抗的机制研究　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分胆碱激酶α促进肝细胞癌进展的机制研究研究背景和目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)的主要组织学类型,在世界范围内最常见恶性肿瘤当中位居第六位,其病死率在肿瘤相关死亡中排名第三位。尽管近年来针对肝细胞癌的诊断和治疗有了很大的进步,然而总体来说肝细胞癌患者的预后仍然不不理想,大部分的肝细胞癌患者被确诊时已处于癌症晚期,缺乏有效的治疗手段,而肝细胞癌患者也主要死于癌症进展过程中发生的肿瘤侵袭与远处转移。包括中国在内的世界多个国家针对肝细胞癌进展的机制进行了深入的研究,取得了一定的发现和成果,然而肝细胞癌进展的分子机制至今仍未系统性阐明。因此,深入研究肝癌进展中肿瘤侵袭和远处转移的分子机制,寻找有效的标志物和治疗靶点,开发更加有效的治疗手段仍然是肝细胞癌研究的重点。胆碱激酶(Choline Kinase)是胆碱代谢通路(Choline Pathway)第一步的反应酶,主要催化由胆碱生成磷酸胆碱的转化过程。近年来,胆碱激酶α(Choline Kinase Alpha,CHKA)及其相关代谢产物曾被报道在多种恶性肿瘤当中表达显著上调,并可以作为患者预后不良的分子标志,更有许多研究报道CHKA具有癌基因的特征。而本课题组的前期研究当中,运用二代测序技术发现肝细胞癌患者的癌组织中存在CHKA的拷贝数扩增并进行了验证;通过扩大临床样本量进行检测发现CHKA在肝细胞癌组织中呈现普遍的高表达,并与肝细胞癌患者的预后不良相关;此外,还通过了一系列的体内外实验证实高表达CHKA可以促进肝癌细胞的侵袭和转移;在初步的机制探索中我们发现了CHKA是通过激活AKT通路从而促进了肝癌细胞的侵袭和迁移。而CHKA如何在肝癌细胞中激活AKT通路,其具体的分子机制是怎样的目前尚不清晰,国内外也暂无系统的报道。本课题旨在深入研究胆碱激酶α(CHKA)促进肝癌细胞侵袭和转移的具体分子机制,寻找关键的节点分子,为肝细胞癌的治疗提供潜在的有效治疗靶点。研究方法:1、运用慢病毒系统构建CHKA的过表达及干扰肝癌细胞系及其相应的对照细胞系;2、应用EGF、HGF等细胞因子刺激结合抑制剂和si RNA介导的基因沉默技术,研究CHKA对AKT信号通路的影响;3、应用Western-blot技术检测信号通路蛋白、磷酸化蛋白水平的变化,应用Transwell小室迁移及Matrigel侵袭实验研究信号通路的变化对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响;4、应用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验研究CHKA与表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)及m TOR复合体2(m TOR complex 2,mTORC2)之间的蛋白质相互作用和共定位关系;5、应用ELISA检测胆碱代谢相关产物,应用CHKA的酶活性抑制剂研究胆碱代谢与肝细胞癌侵袭转移之间的关系;6、应用免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)研究临床肝细胞癌样本中CHKA与p-AKT(Ser473)水平的相关性,并结合临床随访数据进行生存分析,研究CHKA联合p-AKT(Ser473)对肝细胞癌患者预后的判断的价值。研究结果:1、CHKA可以与EGFR发生蛋白质相互作用,促进EGFR的自磷酸化、二聚化以及减少其在EGF刺激下的内化降解;2、CHKA通过整合EGFR-mTORC2-AKT(Ser473)信号通路轴促进肝癌细胞的侵袭和转移;3、CHKA促进肝癌细胞的侵袭转移并不依赖于PI3K(P85)以及PDK1介导的AKT在Thr308位点的磷酸化;4、CHKA可以作为EGFR与mTORC2(RICTOR)之间的接头分子,介导EGFR与mTORC2之间发生蛋白质相互作用,增强mTORC2的激酶活性;5、CHKA可以促进肝癌细胞中的胆碱代谢产物如磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)及磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)的生成,使用CHKA的酶活性抑制剂CK37可以抑制PC及PA的生成,但不能有效抑制CHKA诱导的AKT(Ser473)的磷酸化及肝癌细胞的侵袭和迁移;6、CHKA蛋白水平与p-AKT(Ser473)水平在临床肝细胞癌样本中呈现正相关,两者联合能够更加有效地预测肝细胞癌患者的预后。7、在HCC中发生拷贝数扩增的染色体11q13区段的基因中,CHKA在多个公共HCC数据库中呈现癌组织中的高表达,与HCC具有高度相关性,并且在这些基因中干扰CHKA可以显著下调肝癌细胞的转移能力。结论:在本研究中,我们发现CHKA可以与EGFR蛋白质相互作用,激活EGFR自磷酸化、二聚化并减少其内化降解,同时CHKA还作为EGFR与mTORC2之间的接头蛋白,介导EGFR与mTORC2发生蛋白质相互作用,形成EGFR/CHKA/mTORC2复合体,增强mTORC2的激酶活性,最终导致AKT的Ser473位点磷酸化使AKT过度激活。CHKA促进肝癌细胞侵袭转移主要是通过蛋白质间的相互作用,整合并激活上述EGFR-mTORC2-AKT(Ser473)信号轴而实现,并不依赖于经典的PI3K-PDK1-AKT(Thr308)通路。此外,CHKA可以增强肝癌细胞中PC及PA等代谢产物生成,但使用CHKA酶活性抑制剂并不能有效抑制CHKA诱导的AKT(Ser473)磷酸化及肝癌细胞的侵袭和转移,提示CHKA其分子本身在肝细胞癌进展中起的作用比其酶活性更重要。临床样本中CHKA的表达与p-AKT(Ser473)正相关,两者联合能够更有效预测肝癌患者的预后情况。最后,在HCC组织中发生拷贝数扩增的染色体11q13区段的基因中,CHKA可能促进肝癌转移的关键基因。第二部分胆碱激酶α在EGFR靶向治疗肝细胞癌中的作用及机制研究研究背景和目的:表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是酪氨酸激酶型受体(Receptor Tyrosine Kinase,RTKs)的典型代表,该受体与其配体如表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)结合活化后,能够通过激活下游信号通路如PI3K/AKT通路、MEK/ERK通路等促进细胞增殖,抑制凋亡,以及促进细胞侵袭、转移,被认为在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,因而成为了良好的治疗靶点。EGFR靶向药物主要包括受体特异性酪氨酸激酶活性抑制剂如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib),以及单克隆抗体如西妥昔单抗(Cetuximab)等,在非小细胞肺癌、乳腺癌以及结直肠癌的治疗中得到了广泛的应用并收到了良好的疗效。文献报道约有40%-70%肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者的癌组织中存在EGFR过表达,并且异常活化的EGF信号通路也被报道在肝细胞癌的发生发展中发挥重要促进作用,一些研究者也通过细胞和动物实验证实了EGFR靶向药物可抑制肝细胞癌的发生发展,因而EGFR靶向治疗曾被认为在肝细胞癌的治疗中有良好的应用前景。然而不幸的是,在临床试验当中,应用EGFR靶向药物治疗肝细胞癌效果却不尽如人意。其相应的分子生物学机制仍有待进一步研究。在本课题组的前期研究当中,我们发现了胆碱激酶α(Choline Kinase Alpha,CHKA)在肝细胞癌组织中存在高频高表达,并且CHKA可以作为接头蛋白介导EGFR与m TOR复合体2(m TOR Complex 2,mTORC2)之间发生蛋白质相互作用,激活mTORC2的酶活性过度活化下游AKT从而促进肝细胞癌的侵袭与转移。而肝癌细胞中高表达的CHKA以及其激活的异常信号通路是否参与了肝癌细胞对EGFR靶向治疗药物的抵抗,目前国内外尚无相关报道。本研究旨在深入研究CHKA在肝细胞癌EGFR靶向治疗中的作用及其相应的分子生物学机制,为临床中应用EGFR靶向药物治疗肝细胞癌提供分子标志,以及潜在的有效治疗策略。研究方法:1、应用CCK8短程细胞增殖/存活药物抑制实验研究差异表达CHKA的肝癌细胞系对EGFR靶向药物吉非替尼(Gefitinib)以及厄洛替尼(Erlotinib)治疗的敏感性,并运用非线性回归计算量效关系曲线以及药物对细胞的50%抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50);2、应用长程克隆形成(Colony Formation Assay)药物抑制实验研究高低表达CHKA的肝癌细胞对EGFR靶向药物吉非替尼、厄洛替尼的反应性;3、应用Western-blot检测经EGFR靶向药物处理后,高低表达CHKA的肝癌细胞中信号通路分子以及凋亡分子的变化;4、应用小鼠皮下荷瘤药物抑制实验研究高低表达CHKA的肝癌细胞在体内对EGFR靶向药物治疗的反应,应用western-blot及免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测荷瘤标本中AKT等信号通路分子的水平及增殖、凋亡标志物的水平。研究结果:1、高表达CHKA的肝癌细胞相比低表达CHKA的肝癌细胞在体外对EGFR靶向药物如吉非替尼和厄洛替尼的治疗相对不敏感,在EGFR靶向药物的处理下仍有较高的存活及克隆形成能力;2、在肝癌细胞中过表达CHKA可以使肝癌细胞在体外对EGFR靶向药物吉非替尼和厄洛替尼的治疗发生抵抗,而干扰CHKA可以增加肝癌细胞对EGFR靶向药物的敏感性;3、在小鼠皮下荷瘤模型中,过表达CHKA可使肝癌细胞在体内对EGFR靶向药物厄洛替尼的治疗发生抵抗,其荷瘤生长相比对照组无法被厄洛替尼抑制。4、高表达CHKA介导的EGFR与mTORC2相互作用导致AKT通路的异常活化参与了肝癌细胞对EGFR靶向药物治疗的抵抗,干扰mTORC2的核心成分RICTOR可以使高表达CHKA的肝癌细胞对EGFR靶向药物的治疗变得敏感。结论:在本研究中,我们发现高表达CHKA可以使肝癌细胞在体内外对EGFR靶向药物如吉非替尼、厄洛替尼的治疗发生抵抗,而CHKA介导的EGFR-mTORC2-AKT(Ser473)轴的整合与异常活化在这一药物抵抗过程中发挥了重要作用;提示CHKA可作为EGFR靶向药物治疗肝细胞癌的分子标志,并且联合CHKA治疗肝细胞癌有望成为治疗肝细胞癌的有效策略。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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