IARS2基因在结肠癌中的表达及功能研究

发布时间：2017-12-23 15:52

本文关键词：IARS2基因在结肠癌中的表达及功能研究　出处：《昆明医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,但其发病机制未明,以现有手术、放疗、化疗等治疗手段进行治疗,预后不佳。所以,积极寻找结肠癌的发病机制,尤其是努力找寻可提供早期诊断线索的生物标记物,对于该病的防治意义重大。目前的研究显示：结肠癌的发生、发展过程可能牵涉到多个基因、多种因素的相互作用,包括：生活方式、饮食习惯、环境因素、炎性肠病、癌基因突变、抑癌基因失活等等。IARS2基因是编码线粒体异亮氨酸-tRNA合成酶的核基因,有研究提示：编码线粒体氨酰-tRNA合成酶的基因突变可导致疾病,但IARS2基因与结肠癌的相关性研究目前国内外暂未见报道。在我们的实验中,通过观察病理确诊的人结肠癌与癌旁组织中IARS2基因的表达差异、构建IARS2-siRNA慢病毒载体并感染结肠癌RKO细胞、检测敲减IARS2基因后结肠癌RKO细胞的生物学行为变化,初步探究IARS2基因与结肠癌的关系。研究目的：1、明确结肠癌组织与不同结肠癌细胞株中IARS2基因的表达水平。2、从细胞水平探索敲减IARS2基因对结肠癌RKO细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法：1、对接受结肠癌手术治疗并经病理确诊的6例结肠癌患者的癌组织及健康结肠组织(距原发肿瘤10cm以上组织)进行取材,用实时荧光定量PCR检测IARS2基因在人结肠癌与健康结肠组织的表达水平,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因在人结肠癌与健康结肠组织之间的表达差异。通过实时荧光定量PCR检测IARS2基因在不同的结肠癌细胞株(RKO、 SW480、HCT116、DLD1、HT-29、SW620)中的表达水平,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因在不同结肠癌细胞之间的表达差异。2、设计IARS2-siRNA序列并制备含有IARS2-siRNA序列的重组质粒转染大肠杆菌,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定及测序比对,验证扩增出的重组质粒中是否含有IARS2-siRNA序列。由于目前尚无IARS2蛋白的抗体,不能直接使用IARS2蛋白抗体进行Westernblot检测,故选用RNAi外源筛靶的方法验证靶点干扰的有效性。用含IARS2序列并带有Flag标记的质粒与含IARS2-siRNA的质粒共转染293T细胞作为实验组,对照组将RNAi质粒换为含阴性对照序列的质粒进行共转染,收集转染后36-48小时的实验组和对照组细胞,分别提取蛋白后利用Flag抗体进行Western Blot检测,间接反映IARS2-siRNA序列能否降低细胞中IARS2基因在蛋白水平的表达。将含有IARS2-siRNA的重组质粒与两种辅助包装原件质粒共转染293T细胞并培养至48h以后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并浓缩得到慢病毒浓缩液。将生长状态良好的RKO细胞分为两组：对照组(加入含阴性对照序列的慢病毒)和实验组(加入含IARS2-siRNA的慢病毒)进行RNA干扰实验。慢病毒感染细胞后3天在荧光显微镜下观察GFP的表达情况；慢病毒感染细胞后5天收集RKO细胞,以实时荧光定量PCR检测两组细胞IARS2基因在mRNA水平的表达情况,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因mRNA在实验组和对照组之间的表达差异,观察在mRNA水平IARS2基因的敲减效果。3、将慢病毒感染后的RKO细胞继续培养,在相应的时间进行以下关于细胞生物学行为的实验：将处于对数生长期的两组RKO细胞重悬成细胞悬液接种于96孔板继续培养,从铺板后第二天开始,每天Cellomics检测读板一次,连续检测读板5天,观察两组细胞的增殖情况；当两组RKO细胞在6cm细胞培养皿上生长至覆盖率约为80%时收集细胞,70%乙醇固定并经PI染色,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测,了解两组细胞分别处于G0/G1期、S期、G2/M期的细胞百分率；当两组RKO细胞的细胞汇合度达85%时收集细胞进行Annexin V-APC染色,通过流式细胞仪检测两组细胞的凋亡情况,分别采用凋亡散点图和凋亡峰型图进行分析；将处于对数生长期的两组RKO细胞重悬成细胞悬液接种于6孔板继续培养7天,通过观察细胞在培养板上的克隆形成能力并计数克隆数量,来比较两组细胞的的成瘤能力。结果：1、6对人结肠癌组织和健康结肠组织(距原发肿瘤10cm以上组织)的实时荧光定量PCR检测结果提示：肿瘤组织中IARS2基因mRNA的表达水平高于健康组织；用2-ΔΔCt分析法比较后显示：结肠癌组织的IARS2基因mRNA的表达水平比健康结肠组织的表达水平平均增高近2倍,最高的超过3倍。不同结肠癌细胞的实时荧光定量PCR检测结果提示：在6个结肠癌细胞株中都有IARS2基因的表达；用2-ΔΔct分析法比较后显示：结肠癌RKO细胞株IARS2基因的mRNA表达水平明显高于结肠癌SW480、HCT116、DLD1、 HT-29、SW620细胞株。2、成功构建含IARS2-siRNA的重组质粒,阳性克隆经PCR及测序证实IARS2-siRNA序列插入正确。Western blot检测提示：经转染IARS2-siRNA质粒后,细胞在IARS2蛋白水平明显降低；证明实验中构建的含IARS2-siRNA的慢病毒质粒对IARS2基因的表达有敲减作用。将IARS2-siRNA慢病毒质粒进行慢病毒包装后感染结肠癌RKO细胞,实验组和对照组的感染效率都达到80%以上。经IARS2-siRNA慢病毒感染后的RKO细胞,IARS2基因的mRNA表达水平明显低于Control组；表明IARS2-siRN A慢病毒对IARS2基因在mRNA水平的表达有敲减作用。3、经慢病毒感染后：IARS2-siRNA组RKO细胞生长及倍增速率都慢于Control组。提示：经IARS2-siRNA慢病毒感染后,RKO细胞的生长减缓；IARS2基因可能促进细胞增殖。IARS2-siRNA组RKO细胞处于G0/G1期的细胞较Control组增多,处于S期的细胞较Control组减少；提示：IARS2基因可能影响细胞的周期分布。IARS2-siRNA组RKO细胞的凋亡细胞百分比明显高于Control组；也即：IARS2-siRNA组发生凋亡的RKO细胞显著增加；IARS2基因可能抑制细胞凋亡。IARS2-siRNA组RKO细胞的克隆数目较Control组明显减少；提示IARS2可能促进了细胞的成瘤能力。结论：1、IARS2基因在人结肠癌组织中的表达高于健康组织,但需进一步增加样本量,研究结肠癌患者不同临床分期、病理组织类型与IARS2基因表达的关联性。2、RKO细胞作为工具细胞为IARS2基因研究奠定了基础。3、IARS2基因促进了结肠癌细胞的增殖和细胞成瘤能力,抑制其细胞凋亡。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

【参考文献】