针刺调节抑郁大鼠海马AMPA受体及突触相关蛋白表达的研究

发布时间：2018-01-09 08:00

本文关键词：针刺调节抑郁大鼠海马AMPA受体及突触相关蛋白表达的研究　出处：《广州中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:突触后神经元的兴奋性神经递质受体AMPA受体是抑郁障碍病理生理的重要结构基础和抑郁治疗的重要靶点。本实验通过针刺改善慢性不可预见性温和刺激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)联合孤养致抑郁模型大鼠行为学和针刺调节抑郁大鼠海马突触相关蛋白及AMPA受体亚基表达,来探讨针刺在"谷氨酸-AMPA受体"突触传递及相关突触蛋白表达中的抗抑郁机制。实验一针刺对CUMS联合孤养抑郁模型大鼠行为学的影响方法:选用体重180-220g的成年雄牲SD大鼠30只,随机的分为5组:空白组(n=6),42天造模组,21天造模组,21天造模+针刺组,42天造模+针刺组。其中空白组6只大鼠一起饲养在同一笼子中,其余各组大鼠均采用孤养模型,即单笼饲养。空白组大鼠接受42天普通饲料喂养;21天造模组大鼠,接受42天普通饲料喂养的同时在第1天到第21天连续21天进行慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模;42天造模组大鼠,在接受42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模;21天造模+针刺组大鼠,接受42天普通饲料喂养的同时在第1天到第21天连续21天进行慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模,在第22天接受四关穴针刺治疗,隔日一次,连续治疗21天;42天造模+针刺组大鼠,在接受42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模,在第22天接受四关穴针刺治疗,隔日一次,连续治疗21天。在实验开始前(Day0),第21天(Day21),第42天(Day42)对各组大鼠进行糖水偏好实验(Sucrose Preference Test,SPT)测量。在实验第一天(Day1),第22天(Day22)和第42天(Day42)对各组大鼠进行旷场实验(Open Filed Test,OFT)测量。在实验开始前(Day0),实验第20天(Day20)和实验第40天(Day40)对各组大鼠进行高架十字迷宫实验(The Elevated Plus Maze Test,EMT)测量。即实验第二天(Day2),实验第21天(Day21)和实验第42天(Day42)对各组大鼠进行避暗实验(Passive Avoidance Test,PAT)测量。统计方法:采用SPSS20.0统计软件对实验数据进行统计分析,实验计量资料若服从正太分布,结果以均数±标准差(x±s),各组间差异及比较采用单因素方差分析(One-ANOVA)最小显著差法(LSD),以p0.05为有统计学意义。组间比较采用方差分析,不服从正态分布或方差不齐,采用非参数秩和检验;多个不同时间比较采用重复测量方差分析,不满足协方差矩阵或球形检验采用矫正检验方法及两两比较,或者采用多远方差分析,检验水平α =0.05。结果:1.糖水偏好实验结果显示:在实验开始前(Day0),各组大鼠糖水偏好值并没有统计学差异,F_(4,25)= 0.089,p ＞ 0.05。在第 21 天(Day21),4 组 CUMS 造模组大鼠,即42天造模组、21天造模组、21天造模+针刺组、42天造模+针刺组,均与空白组有统计学差异,F(425)= 10.246,p0.01。在第42天,各组间的糖水偏好值均有统计学差异,F_(4,25)= 24.578,p0.01。经过42天CUMS造模后,42天造模组的糖水好值均明显低于空白组(P0.01),21天造模组(P0.01)和42天造模加针刺组(P0.01)。从实验第22天开始,尽管21天造模组的糖水偏好值在第42天(Day42)较第21天(Day21)有所升高,其偏好值仍然低于空白组(P0.01)。Group D在接受21天针刺治疗后,偏好值明显有所升高,且与空白组(P0.01)没有显著统计学差异,并且21天造模+针刺组的值高于42天造模组(P0.01),21天造模组(P0.01)和42天造模+针刺组(P0.01)。2.旷场实验主要观察大鼠在场箱里的水平运动总路程(Crossings)和爬壁站立次数(Rearings),结果显示:在第一次实验中(Day1),5组大鼠场箱内水平运动总路程和爬壁站立次数没有统计学差异,F_(4,25)= 0.025,p0.05;F_(4,25)= 0.026,p0.05。实验第22天(Day22),4组CUMS造模组大鼠,即42天造模组、21天造模组、21天造模+针刺组、42天造模+针刺组均与空白组有统计学差异,p0.01。在试验第42天(Day42),5组大鼠场箱内水平运动总路程和爬壁站立次数有显著统计学差异,P(4,25)= 5.35,p0.01;P(4,25)= 5.34,p0.01。21 天造模+针刺组大鼠水平运动总路程和爬壁站立次数与空白组相近,21天造模+针刺组和空白组均明显高于42天造模组和21天造模组(p0.01;p0.01);42天造模+针刺组明显高于42天造模组(p0.01)。3.高架十字迷宫实验主要观察分析各组大鼠在开臂及闭臂中活动时间比值,结果显示:在第一次实验中(Day0)各组大鼠实验结果并没有统计学差异,F_(4,25)= 0.085,P ＞ 0.05。经过 20 天 CUMS 造模后,F_(4,25)= 10.246,p0.01,4 组 CUMS 造模组大鼠,即42天造模组、21天造模组、21天造模+针刺组、42天造模+针刺组,均与空白组有统计学差异(P0.01)。在第三重测量中(Day40),5组大鼠比值具有统计学差异,F(4.25)= 6.179,p0.01。从组间比较来看,空白组的比值均高于其他组,F_(4,25)=34.946,p0.01。空白组和21天造模+针刺组,43天造模组和21天造模组以及21天造模+针刺组和42天造模+针刺组之间并没有统计学差异,P0.05。21天造模+针刺组高于42天造模组(P0.05)和21天造模组(P0.05)。4.避暗实验主要观察分析大鼠的潜伏期,结果显示:在第一次避暗实验中(Day2),各组大鼠的潜伏期并没有统计学差异,(F_(4,25)= 0.186,p0.01)。在第二次试验中(F_(4,25)= 45.675,p0.01),各组大鼠的潜伏期并具有显著统计学差异,空白组潜伏期明显短于其他4 CUMS造模组。在试验第42天(Day42),各组大鼠潜伏期具有显著统计学差异,F_(4,25)= 45.675,p0.01。从组间比较看,空白组明显低于其他各组(P0.05);21天造模+针刺组低于42天造模组(P0.01),21天造模组(P0.01)和42天造模+针刺组(P0.01)。5.本研究证实:(1)21和42天两种CUMS造模方式的大鼠都会出现明显抑郁样行为,且42天CUMS模型大鼠抑郁样行为更严重;(2)大鼠在经过21天CUMS刺激出现抑郁样行为,继续给予21天CUMS刺激抑郁样症状会加重,但是加重的趋势缓慢;(3)大鼠在经过21天CUMS刺激出现抑郁样行为后,不再继续给予CUMS刺激,其抑郁样行为虽然有所恢复仍然可以维持3周;(4)针刺可以良好的改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁样行为,针刺具有抗抑郁疗效;(5)针刺可改善不同轻重程度CUMS抑郁模型大鼠的抑郁样行为,且抑郁程度越轻疗效越明显。实验二针刺对CUMS联合孤养抑郁模型大鼠海马突触相关蛋白及AMPA受体亚基表达的影响方法:选用体重180-220g的成年雄性SD大鼠30只,随机分5组:空白组;CUMS模型组;CUMS+针刺组;CUMS+假针刺组;CUMS+针刺+侧脑室注射AMPA受体阻断剂预处理组,每组6只。空白组6只大鼠一起饲养在同一笼子中,其余各组大鼠均采用孤养模型,即单笼饲养。空白组:大鼠接受42天普通饲料喂养;CUMS模型组:大鼠接受连续42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模;CUMS+针刺组:大鼠接受连续42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激CUMS)造模,第22天接受四关穴针刺治疗,隔日一次,连续治疗21天。CUMS+假针刺组:大鼠接受连续42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模,第22天接受四关穴假针刺治疗,假针刺组取穴针刺时间均同针刺组,但针刺时不刺入皮下,隔日一次,连续治疗21天。CUMS+针刺+侧脑室注射AMPA受体阻断剂预处理组:大鼠接受连续42天普通饲料喂养的同时进行连续42天慢性不可预见性温和刺激(CUMS)造模,第22天接受四关穴针刺治疗,在每次针刺治疗前给予大鼠侧脑室注AMPA受体阻断剂NBQX,30min后再给予针刺,隔日一次,连续治疗21天。采用Western Blot及免疫荧光双标技术观察针刺对CUMS联合孤养抑郁模型大鼠海马突触相关蛋白CaMKⅡ、Stargazin、PSD-95、PICK1、p-GLUR1、P-GLUR2、GLUR1、GLUR2 及 AMPA 受体亚基 GluR1、GluR2 的表达情况。结果:通过Western Blot的实验结果分析可见:与空白组比较,CUMS模型组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马Stargazin蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.000);与空白组比较,CUMS+针刺组大鼠海马Stargazin含量没有显著性差异(P=0.498);与空白组比较,CUMS+假针刺组大鼠海马Stargazin蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.01);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组,CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异。(P=0.061,P=0.227)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马p-GLUR1蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);与空白组比较,CUMS+针刺组大鼠海马 p-GLUR1含量没有显著性差异(P=0.056);与CUMS模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马p-GLUR1蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.00,P=0.01);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.235);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较有显著性差异(P=0.025)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马P-GLUR2蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);与空白组比较,CUMS+针刺组大鼠海马 P-GLUR2含量没有显著性差异(P=0.077);与CUMS模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马P-GLUR2蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.00,P=0.000);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.091);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较有显著性差异(P=0.012)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马p-CamkⅡI蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.000,P=0.000,);与空白组比较,CUMS+针刺组大鼠海马p-CamkⅡ含量没有显著性差异(P=0.332);与CUMS模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马p-CamkⅡ蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.000,P=0.200);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.210);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.242)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+针刺组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马Pick1蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.027,P=0.000,P=0.000);与 CUMS 模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马Pick1蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.000,P=0.000);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.064);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马Pick1蛋白含量均明显增加,并且有显著性差异(P=0.2)。CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺组两两比较,大鼠海马Pick1蛋白含量均明显降低,并且有显著性差异(P=0.002)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+针刺组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马PSD95蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.008,P=0.000,P=0.000);与 CUMS 模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马PSD95蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.000,P=0.000);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.368);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺组两两比较无显著性差异(P=0.062);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马PSD95蛋白含量均明显增加,并且有显著性差异(P=0.001)。与空白组比较,CUMS模型组、CUMS+针刺组、CUMS+假针刺组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马GLUR1蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.001,P=0.000,P=0.000);与 CUMS 模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马GLUR1蛋白含量增加,且有显著性差异(P=0.000,P=0.02);CUMS模型组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较无显著性差异(P=0.118);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺组两两比较大鼠海马GLUR1蛋白含量降低,但并无显著性差异(P=0.063);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马 GLUR1蛋白含量明显增加,但是并无显著性差异(P=0.084);CUMS+针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马GLUR1蛋白含量明显增加,并且有显著差异(P=0.001)与空白组比较,CUMS模型组和CUMS+针刺+AMPA阻断剂预处理组大鼠海马GLUR2蛋白含量均明显降低,分别比较均有显著性差异(P=0.000,P=0.000);与空白组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马GLUR2蛋白含量降低,分别比较无显著性差异(P=0.671,P=0.087);与CUMS模型组比较,CUMS+针刺组和CUMS+假针刺组大鼠海马GLUR2蛋白含量均增加,且有显著性差异(P=0.000,P=0.02);与CUMS模型组比较,CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组大鼠海马GLUR2蛋白含量均增加,但是两两比较无显著性差异(P=0.382);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺组两两比较,CUMS+假针刺组大鼠海马GLUR1蛋白含量降低,但并无显著性差异(P=0.189);CUMS+针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马GLUR2蛋白含量明显增加,并且有显著差异(P=0.001);CUMS+假针刺组与CUMS模型+针刺+AMPA受体阻断剂预处理组两两比较,大鼠海马GLUR2蛋白含量降低,有显著性差异(P=0.016)。从免疫荧光双标实验结果可见:GluR1受体亚基在空白组和CUMS+针刺组中高表达,而GluR2受体亚基在CUMS+针刺组及假针刺组高表达,GluR1受体亚基和GluR2受体亚基在CUMS模型组和CUMS模型+针刺+阻断剂预处理组中均未见高表达。结论本研究通过上述两个实验佐证证明:(1)针刺能很好的调节慢性不可预见性温和刺激联合孤养模型抑郁症大鼠行为学改变。(2)针刺能增强慢性不可预见性温和刺激联合孤养模型大鼠海马突触相关蛋白GLUR1、p-GLUR1、GLUR2、p-GLUR2、Stargazin、p-Camk Ⅱ、Pick1、PSD95的表达。(3)针刺能增强慢性不可预见性温和刺激联合孤养模型大鼠海马AMPA受体亚基GluR1和GluR2的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R245

【参考文献】