CTRP3调控AMPK减轻脑出血继发性损伤的作用及机制研究

发布时间：2019-04-19 09:57

【摘要】：背景:脑出血患者神经系统逐步恶化的同时伴有大量神经元的减少和血管的损害。血管再生可以预防脑出血后继发性神经元损伤,对脑出血患者而言,血管再生将是一个有效的目标靶点。C1q/肿瘤坏死因子(TNF)相关蛋白-3(C1q/tumor necrosis factor(TNF)-related protein 3,CTRP 3)是最近发现的一个新的脂肪因子,与脂联素是同源异构物的关系。CTRP3具有很多的生物学功能,比如促进血管新生、抗炎、抗凋亡、抗氧化应激反应等。小鼠动物实验研究表明,CTRP3可以促进心肌梗死周围缺血区血管新生,但是其在脑出血中是否也能够起到促进血肿周围缺血区的新生血管的形成,目前尚未见文献报道,具体的作用机制也不甚清楚。目的:本课题通过对脑出血动物体内模型的复制,(1)探讨CTRP3在脑出血后继发性损伤中的神经保护作用。(2)探讨CTRP3是否可以促进脑出血后血肿周围血管新生,并进一步探讨其调控机制。方法:1、建立稳定可靠的大鼠脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)模型:从大鼠股动脉抽取50μL全血注入同侧大脑纹状体,通过一个26 G直径的针插入到纹状体,深度为颅骨表面5.8 mm以下,手动注血10 min以上,建立ICH模型。2、观察外源性重组CTRP3(recombinant CTRP3,r CTRP3)蛋白对脑出血继发性损伤的神经保护作用:(1)实验设计将成年SD大鼠随机分为四组:假手术(sham)组、脑出血模型(ICH)组、ICH+试剂对照(ICH+vehicle)组和ICH+重组CTRP3蛋白(ICH+r CTRP3)组。(2)脑出血后30分钟后r CTRP3侧脑室注射(80μg/kg),然后每周三次直到动物被处死。(3)脑出血7 d后对所有大鼠进行神经功能评分(通过改进的Garcia试验,平衡木试验和肌力挂线试验来评估);检测血脑屏障完整性和脑水肿。(4)CD31免疫组化检测血管标记物含量。(5)采用western blot观察r CTRP3对CTRP3,AMPK、HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响。(6)采用q RT-PCR分析CTRP3、HIF-1α、VEGF m RNA表达的改变情况。3、观察慢病毒过表达CTRP3(Lentivirus overexpression of CTRP3,Lenti-CTRP3)对脑出血继发性损伤的神经保护作用:(1)实验将成年SD大鼠随机分为四组:假手术(sham)组、脑出血模型(ICH)组、ICH+阴性病毒对照(ICH+Lenti.Null)组和ICH+慢病毒过表达CTRP3蛋白(ICH+Lenti-CTRP3)组。(2)慢病毒通过侧脑室注射14 d后再建立脑出血模型。(3)脑出血7 d后对所有大鼠进行神经功能评分(通过改进的Garcia试验,平衡木试验和肌力挂线试验来评估);检测血脑屏障完整性和脑水肿。(4)CD31免疫组化检测血管标记物含量。(5)采用western blot观察Lenti-CTRP3对CTRP3、AMPK、HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响。(6)采用q RT-PCR分析CTRP3、HIF-1α、VEGF m RNA表达的改变情况。4、探讨AMPK/HIF-1α/VEGF信号通路在CTRP3抵抗脑出血性损伤的作用:进一步分别给予AMPK和VEGF所对应的抑制剂Compound C和CBO-P11进行干预,检测该通路对CTRP3抵抗脑出血性损伤的影响。结果:1、外源性重组CTRP3蛋白或慢病毒CTRP3过表达,对脑出血继发性损伤的神经保护作用具有相同趋势,CTRP3治疗后可明显减轻脑水肿的程度,保护血脑屏障,改善神经功能,并促进血管生成,与ICH组相比存在明显的统计学差异(P0.01)。2、CTRP3可以增加AMP活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化以及缺氧诱导因子1(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,p AMPK/AMPK比值、HIF-1α、VEGF的表达均高于ICH组,并且与ICH模型组相比存在显著性差异(P0.01)。3、用AMPK抑制剂Compound C阻断AMPK的活化后,p AMPK/AMPK比值、HIF-1α和VEGF表达均低于r CTRP3单纯处理组,而用VEGF抑制剂CBO-P11只能降低VEGF表达。AMPK或VEGF抑制剂可以完全消除CTRP3诱导毛细血管的形成。然而,AMPK抑制剂使r CTRP3的神经保护作用完全消除,VEGF抑制剂只是部分消除r CTRP3的神经保护作用。这些结果表明,虽然CTRP3的神经保护作用主要是通过AMPK/HIF-1α/VEGF通路诱导血管生成的机制介导的,可能还有其它机制也参与了CTRP3在大鼠脑出血后继发性损伤的神经保护作用。结论:CTRP3能减少神经功能缺损、上调促血管生成因子的表达、诱导血管生成、减轻脑水肿、保护血脑屏障,从而抵抗脑出血继发性损伤。CTRP3可能通过AMPK/HIF-1α/VEGF信号通路发挥其促血管生成作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.34

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本文编号：2460840