miR-145在浆液性卵巢癌发生发展中的作用和机制研究

发布时间：2017-03-18 03:01

  本文关键词：miR-145在浆液性卵巢癌发生发展中的作用和机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,且是公认病死率最高的妇科恶性肿瘤。浆液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma, SOC)是其中最常见和恶性程度最高的亚型,五年生存率仅30%,究其原因是缺乏有效的早期诊断策略以及化疗耐药所导致的复发。70%的浆液性卵巢癌患者在就诊时已是晚期。70%的患者又在手术和化疗后复发。浆液性卵巢癌包括高级别和低级别两种,最新的研究观点认为二者均起源于输卵管上皮细胞。而浆液性卵巢癌同时是一个基因病,研究发现浆液性卵巢癌,尤其是高级别浆液性卵巢癌是DNA不稳定肿瘤,96%的患者有TP53突变,并在此基础上伴有一系列原癌基因激活,抑癌基因失活及信号通路异常。尽管如此,浆液性卵巢癌的发生发展机制并不十分明确,可预测其治疗效果及预后等的分子标记物仍然十分有限。发现浆液性卵巢癌的发生发展过程中的关键基因和调节通路是浆液性卵巢癌研究重点,将会有利于早期诊断和有效治疗,从而降低其病死率。microRNA (miRNA)是近年来发现的一类来源于内源性染色体上的非编码RNA,平均长度约为22个核苷酸。它们基于与靶基因mRNA的3’非翻译区(un-translational region, UTR)序列互补,能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶mRNA降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。根据其所调控的靶基因的功能不同,miRNA可扮演原癌基因或抑癌基因的角色,在恶性肿瘤发生以及转移中发挥重要作用。有报道一部分miRNA可以为p53调控表达,更奠定了其在恶性肿瘤中的重要地位。miR-145是可以被p53调控的miRNA之一。研究人员发现miR-145在多种人类恶性肿瘤中通过调控不同的靶基因参与肿瘤发生发展。但miR-145异常表达在浆液性卵巢癌中的作用尚不明确,其发挥作用的上下游机制更是有待进一步研究。因此本课题主要致力于研究miR-145在浆液性卵巢癌发生发展中作用以及具体机制,研究内容分为以下三部分。一.miR-145在浆液性卵巢癌中的异常表达及对增殖转移能力的影响；二.miR-145在浆液性卵巢癌中发挥作用的关键下游靶基因的鉴定；三.miR-145在浆液性卵巢癌中异常表达的上游调控机制。第一部分miR-145在浆液性卵巢癌中的异常表达及对增殖转移能力的影响目的：已有研究表明miR-145在多种恶性肿瘤中异常低表达,包括乳腺癌,胃癌及膀胱癌等,且miR-145可以抑制瘤细胞的增殖和转移能力,从而起到抑制肿瘤发生发展的作用。但miR-145在浆液性卵巢癌中具体起到什么作用,目前为止尚不完全明确。本研究首先通过检测浆液性卵巢癌组织标本及细胞系中miR-145的表达初步确立其角色,再通过调控细胞系中miR-145的表达水平来进行体外和体内实验以检测其对卵巢癌细胞增殖转移能力的影响。方法：收集浆液性卵巢癌组织和对照输卵管组织各5例并提取RNA,行miRNA芯片检测,观察miR-145在差异表达miRNA中所占地位。扩大样本量采用qPCR方法检测浆液性卵巢癌组织和对照组织中miR-145的表达差异,以及卵巢癌细胞系和正常对照细胞系中miR-145的表达水平。选取三种卵巢癌细胞系(SKOV3,A2780和HEY),通过慢病毒感染的方式上调miR-145的表达。然后体外行MTT法测定生长曲线,平板克隆形成实验测定克隆形成能力,以检测细胞系增殖能力的改变。计数并比较Transwell小室实验中穿壁细胞的数目来检测调控miR-145表达后细胞迁移和侵袭能力的改变。体内实验采用裸鼠皮下移植瘤以及尾静脉注射肺转移模型。皮下移植瘤模型中,统计miR-145过表达组和对照组的肿瘤大小和重量,以比较成瘤能力的差异。尾静脉注射模型中,统计肺转移结节的多少来判定肺转移能力的差别。结果：miRNA芯片结果显示,与对照输卵管组织相比,miR-145在浆液性卵巢癌组织中表达明显降低,且是表达差异最明显的miRNA。QPCR验证实验结果表明,miR-145在浆液性卵巢癌(包括48例高级别和20例低级别)的表达低于在对照组织(n=19)的表达,差异有统计学意义,在6种卵巢癌细胞系中的表达也均低于在正常对照细胞的表达。三种细胞系在过表达miR-145后,其体外增殖能力降低,侵袭迁移能力下降,裸鼠体内成瘤能力和肺转移能力也下降。结论：miR-145在浆液性卵巢癌中扮演抑癌基因的角色,其高表达能降低卵巢癌的增殖和转移能力。第二部分miR-145在浆液性卵巢癌中发挥作用的关键下游靶基因的鉴定目的：miRNA发挥作用的机制是通过与靶基因的mRNA结合进而降解或者抑制其翻译。已有报导miR-145在不同肿瘤中可与不同的下游基因结合并调控表达,进而发挥抑制肿瘤恶性行为的作用。本研究旨在阐明在浆液性卵巢癌中与miR-145直接结合并受其调控的靶基因,以及该靶基因是否可以影响卵巢癌细胞的恶性行为。方法：综合预测软件targetscan与课题组此前做过的浆液性卵巢癌的蛋白组学芯片,筛选出候选基因metadherin (MTDH). Western blot检测卵巢癌细胞系和正常对照细胞系中MTDH表达差异,同时提取卵巢浆液性癌组织以及正常对照组织的蛋白,检测MTDH在两种组织中表达差异。进一步检测三种卵巢癌细胞系上调以及下调miR-145后,细胞中MTDH蛋白水平的变化。同时分析比较卵巢癌细胞系和输卵管上皮细胞中MTDH和miR-145基础表达水平的相关性。双荧光素酶报告基因实验验证MTDH是否miR-145的直接下游靶基因。为确认MTDH作为miR-145下游功能性的直接靶点影响卵巢癌细胞恶性行为,采用rescue实验检测MTDH的过表达是否可以逆转miR-145对卵巢癌细胞的抑制。Western blot检测间质上皮转化相关分子的变化以确认miR-145与MTDH的相互作用对下游通路和细胞恶性行为的影响。免疫组化检测具有随访资料的浆液性卵巢癌患者的MTDH表达,并通过生存曲线分析MTDH表达水平与浆液性卵巢癌病人预后的关系。结果：MTDH是原癌基因,在课题组之前的蛋白组学芯片中已经发现其在浆液性卵巢癌中高表达。软件预测显示MTDH mRNA 3'UTR和miR-145有两处可以结合的保守序列。MTDH蛋白在6种卵巢癌细胞系中表达均高于在对照细胞中的表达。浆液性卵巢癌组织(包括48例高级别和26例低级别)中MTDH蛋白表达高于正常对照组织(n=13)。且在miR-145上调的细胞系中,MTDH蛋白水平明显下降；相反,miR-145下调细胞系中则MTDH蛋白表达上升。而综合分析6种卵巢癌细胞和1种输卵管上皮细胞中miR-145和MTDH表达,发现二者呈负相关。双荧光素酶报告基因实验中,miR-145可以降低构建的MTDH 3'UTR野生载体而非突变载体的荧光活性。Rescue实验结果显示,在miR-145稳定转染细胞中转入MTDH后,降低的细胞增殖,迁移和侵袭能力重新恢复。Western blot结果提示在miR-145转染细胞中,除MTDH下降外,上皮分子(E-cadherin)表达上升,而间质分子(N-cadherin, Vimentin, Fibronectin和ZEB-1)表达下降。生存分析发现MTDH高表达的浆液性卵巢癌患者预后更差,具体表现为总生存期的缩短。结论：浆液性卵巢癌中MTDH是miR-145的直接和功能性的下游靶基因,miR-145对MTDH的负性调控影响浆液性卵巢癌的恶性行为和病人预后。第三部分miR-145在浆液性卵巢癌中异常表达的上游调控机制目的：许多miRNA可以为p53调控,已有报导miR-145的表达受野生p53的直接正性调控。基于大部分浆液性卵巢癌尤其是高级别浆液性卵巢癌存在TP53突变,我们推测在TP53正常的浆液性卵巢癌中,上游野生p53诱导miR-145上升并进而抑制下游MTDH发挥了抑制肿瘤进展的功能,而在TP53突变的浆液性卵巢癌中,miR-145因缺少p53诱导而表现为异常低表达。TP53突变,miR-145低表达,MTDH高表达可能为大部分浆液性卵巢癌发生发展中的重要机制。因此本研究旨在通过体外诱导p53以及在浆液性卵巢癌组织样本中进行验证来确认miR-145是否为野生p53诱导。方法：选取表达野生型p53的卵巢癌细胞系(A2780和HEY)以多柔比星(doxorubicin, DOX)药物进行诱导p53表达。QPCR和western blot分别检验miR-145和MTDH及p53的表达改变。组织标本实验中,以免疫组化检测p53在浆液性卵巢癌中表达并分为野生p53组和突变p53组后,分析比较两组中miR-145表达差异。综合第一部分研究内容中miR-145在浆液性卵巢癌组织中表达水平,以及第二部分内容中MTDH在浆液性卵巢癌组织中蛋白表达的western blot结果,分析二者之间的相关关系。再将第二部分中分析预后的MTDH免疫组化结果与此部分p53免疫组化结果比较,看两者在浆液性卵巢癌中表达是否相关。结果：DOX处理卵巢癌细胞系后,野生p53明显上升,并同时伴有miR-145的上升和MTDH的下降。浆液性卵巢癌野生p53组的miR-145表达高于突变p53组。miR-145和MTDH在浆液性卵巢癌组织中表达呈负相关。而免疫组化结果显示突变p53和MTDH的表达呈正相关。结论：浆液性卵巢癌中miR-145的异常可能由上游p53异常所致。p53, miR-145和MTDH形成了一个线性调节通路影响浆液性卵巢癌的进展。论文重点阐述了miR-145在浆液性卵巢癌发生发展中扮演的角色作用以及其发挥作用的上下游调节机制。创新之处主要表现为以下几点：1.对miR-145在浆液性卵巢癌中所发挥作用进行了详实完整的体外体内和组织标本学研究,其抑癌基因的角色得到全面证实；2.首次提出MTDH是miR-145的直接下游靶基因,MTDH受miR-145负调控影响浆液性卵巢癌的恶性行为和患者预后；3.对miR-145在浆液性卵巢癌中低表达的上游调节机制进行研究,指出miR-145的异常表达可能为上游野生p53失活所致；4.首次阐述了p53-miR-145-MTDH的线性调控关系,并指明其是浆液性卵巢癌发生发展中的重要调控机制。本论文尚存在不足之处,也将会是我们未来的研究方向。主要表现为：1.论文对浆液性卵巢癌增殖和转移的能力进行了研究,而化疗药物敏感性未有研究。浆液性卵巢癌患者化疗耐药和复发是其预后差的一大原因。p53-miR-145-MTDH调控轴是否影响浆液性卵巢癌化疗敏感性,需要进一步设计药敏实验验证。2.论文提出p53是miR-145异常表达的上游调控机制。高级别浆液性卵巢癌患者存在高的TP53突变率,因此p53-miR-145-MTDH轴在高级别患者肿瘤发生发展中发挥重要作用。但是低级别浆液性卵巢癌中虽然同样存在miR-145的低表达,其TP53突变率低,因此,低级别患者中miR-145异常低表达可能有p53之外的上游调控机制,这一点也我们需要进一步探索。3.课题研究中所使用的细胞系均较古老,有学者认为有些细胞系不能证明是浆液性卵巢癌来源。因此构建新的浆液性卵巢癌细胞系,尤其是针对高级别和低级别浆液性癌分别构建对应细胞系将会有重要意义。4.缺少浆液性卵巢癌对应的转基因小鼠模型,课题组目前正在构建中的输卵管特异性的p53突变转基因小鼠模型,或许可以应用到未来的研究中,并用来检验论文提出的p53-miR-145-MTDH调控轴假说。
【关键词】：miR-145 浆液性卵巢癌 抑癌基因 增殖 转移 miR-145 浆液性卵巢癌 靶基因 MTDH 预后 miR-145 浆液性卵巢癌 上游 p53 相关
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 符号说明21-23
• 前言23-25
• 第一部分25-46
• 前言25-26
• 材料与方法26-42
• 1.实验材料26-30
• 2.实验方法30-42
• 结果42-44
• 1.miRNA巧片显示miR-145在SOC中低表达42-43
• 2. QPCR验证miRNA巧片的正确性43
• 3. QPCR检验miR-145在大样本SOC a及细胞系中的表达43
• 4.构建过表达m化-145的卵巢癌细舱系43
• 5.过表达miR-145的细胞X椫衬芰Ω谋
  
  本文编号：253799
  boshi