肠易激综合征肠上皮—肠胶质细胞网络调控异常的分子机制研究

发布时间：2020-07-28 11:54

【摘要】：背景和目的肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IB S)是消化系统发病率较高的慢性功能性胃肠疾病。其主要症状为腹痛和腹部不适,并伴有排便习惯和粪便性状的改变,而经系统的实验室及相关辅助检查却无器质性病变。腹痛是而肠易激综合征患者的主要主诉症状之一,其发生的严重程度及频率显著影响IBS患者的生活质量。目前IBS腹痛发生的机制尚未完全明确,大量研究提示内脏敏感性增高是IBS腹痛发生的重要病理生理机制之一。目前认为IBS内脏高敏感的发生可能包含了中枢致敏和外周致敏两大不同的病理生理过程,他们可能分别或共同参与了IBS不同的发病起始,然而,我们对IBS中枢或外周致敏的诱发机制仍然知之甚少。近年来,一系列研究发现IBS患者结肠粘膜组织成分存在明显改变,并与IBS内脏高敏感密切相关,这些异常改变包括局部免疫的激活引起的肠嗜铬细胞释放5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)增多以及肥大细胞激活释放组胺增多等。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神经营养素家族的主要成员之一,广泛分布于中枢及周围神经系统,在神经元分化及发育成熟过程中起重要作用。大量研究表明BDNF同时也是一种疼痛调节介质,其在不同病理生理条件下的异常表达升高参与了诸多病理性疼痛的起始和维持。研究发现,除在中枢表达外,人肠道也表达BDNF,我们之前发表的一项研究发现IBS患者,主要是腹泻型IBS (diarrhoea-predominant IBS, IBS-D)患者,结肠粘膜上皮及固有层BDNF表达显著高于正常对照,并与患者腹痛程度和频率显著相关,提示肠道BDNF在IBS患者腹痛发生中可能发挥重要作用。然而,IBS患者结肠BDNF高表达的起始因素以及BDNF参与IBS腹痛发生的分子机制目前仍不清楚。多项研究均发现IBS-D患者粪便丝氨酸蛋白酶活性显著升高,并且通过激活蛋白酶活化受体-2 (protease activated receptor-2, PAR-2)增加IBS-D肠道通透性,继而参与调节内脏敏感性。而PAR-2受体的激活同时参与上皮细胞分泌功能的调节,因此,IBS-D患者结肠上皮表达增高的BDNF是否归因于其肠内容物中升高的丝氨酸蛋白酶活性及其继而激活的PAR-2信号通路,值得我们深入探讨。肠胶质细胞网络(Enteoglial cells, EGC)是整个肠道独有的特殊网络,越来越多的证据提示EGC在肠道稳态包括肠道动力,分泌,吸收和肠屏障功能均有重要作用。而EGC与中枢星形胶质细胞表达同样的激活标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP),鉴于星形胶质细胞在神经病理性疼痛的发生中的显著作用,IBS患者肠上皮释放增多的BDNF,是否可通过影响EGC网络,进而引起肠道感觉信息的传递异常呢?基于以上理论和发现,本研究分三个部分对以上问题进行探讨,第一部分研究IBS患者结肠BDNF过表达可能的起始机制,包括：1.检测IBS-D患者结肠内容物上清液刺激后人结肠上皮细胞BDNF的表达改变；2.探讨IBS-D患者结肠内容物上清提取液诱导人结肠上皮细胞BDNF的表达的分子机制。第二、三部分探讨肠粘膜BDNF过表达介导IBS腹痛发生的分子机制,研究包括：1.探讨IBS患者肠粘膜中BDNF及其受体Tropomyosin receptor kinase B (TrkB)表达的改变,EGC网络相关标记物和分泌因子的改变,并探讨这些可能存在的改变与IBS腹痛症状的相关性(第二部分)。2.应用IBS-D患者粪便上清诱导的小鼠内脏高敏感模型,以及EGC功能障碍小鼠模型,并借助于BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠对比,探讨BDNF与EGC激活的关系以及EGC网络改变在内脏高敏感发生中的直接作用。最后通过体外EGC培养和肠系膜神经放电实验,探究BDNF对EGC作用的相关分子机制,以及BDNF自身和EGC激活分别对肠感觉传入神经兴奋性和机械敏感性的直接作用(第三部分)。方法第一部分依据功能性胃肠病罗马III标准连续纳入22例IBS-D患者和17例正常对照者,收集每位受试者新鲜粪便,经处理后提取上清液(Fecal supernatants, FSN),应用azo-casein法测定上清液蛋白水解酶活力。应用丝氨酸蛋白酶抑制剂验证IBS-D FSN升高的蛋白酶活性依是否赖于丝氨酸蛋白酶。FSN分别刺激6小时和24小时提取细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR检测BDNF和PAR-2 mRNA表达；同时收集细胞培养液上清,应用ELISA测定上清BDNF浓度。提取总蛋白,Western blotting检测PAR-2表达。应用人结肠腺癌来源的上皮细胞系Caco-2行体外培养,应用靶向PAR-2基因的小干扰RNA(siRNA)沉默Caco-2细胞PAR-2基因,并在接受IBS-D FSN和对照FSN刺激24小时后检测PAR-2和BDNF蛋白的表达。结合PAR-2拮抗剂,p38 MAPK和NF-κB抑制剂,检测IBS-D FSN对以上两种信号通路蛋白表达的影响。选用野生雄性C57BL/6小鼠,应用IBS-D FSN结肠灌注诱导小鼠结肠高敏感。结合BDNF拮抗剂,丝氨酸蛋白酶抑制剂和PAR-2拮抗剂,通过结直肠扩张(Colorectal distention, CRD)和腹壁肌电实验检测小鼠内脏敏感性变化。收集灌注部位的小鼠结肠组织,Western blotting和免疫组化染色检测BDNF的表达和分布。第二部分根据罗马III标准入选IBS患者和正常对照者,每位IBS患者完成一份肠道功能评分量表,进行腹痛严重程度和频率评分。收取IBS和正常对照者粪便,提取上清。每位受试者接受结肠镜检查,并在直肠乙状结肠交界处收取6块活检标本,2块用于常规组织学检查和免疫组织化学,2块用于western blotting,2块用于透射电镜检查。应用免疫组织化学检测活检标本结肠粘膜中BDNF和GFAP表达,荧光双标检测TrkB受体和P物质(Substance P, SP)在EGC和肠神经纤维中的表达。Western blotting进一步定量BDNF, GFAP和TrkB在肠粘膜中的表达,并分析与腹痛评分的相关性。应用透射电镜观察EGC形态学改变,并定量EGC中异染色质,线粒体,糖原颗粒,高尔基体和核糖体数目的改变。第三部分应用IBS-D患者粪便上清以及BDNF+/-C57BL/6小鼠和同窝出生BDNF+/+野生小鼠构建模拟IBS的内脏高敏感模型。结合丝氨酸蛋白酶抑制剂,BDNF拮抗剂和EGC代谢抑制剂,通过CRD和腹壁肌电实验检测小鼠内脏敏感性检测变化。收集灌注部位结肠组织,应用western blotting和免疫组织化学和免疫荧光染色检测结肠粘膜BDNF, GFAP, TrkB和SP的表达。应用人重组BDNF (r-HuBDNF)体外刺激大鼠肠胶质细胞系,结合PLC-γ1抑制剂和TrkB拮抗剂进一步检测TrkB-PLCγ1信号通路是否参与BDNF对EGC的激活,以及EGC激活后SP表达的改变。应用大鼠空肠肠系膜神经放电实验检测EGC培养液上清和r-HuBDNF对肠系膜传入神经兴奋性放电和机械敏感性的影响,进一步验证EGC激活和BDNF对肠道感觉传入神经兴奋性和敏感性的直接作用。结果第一部分1.IBS-D患者粪便上清液中丝氨酸蛋白酶活性明显升高IBS-D FSN总蛋白酶活性为1461±143.1 U/mg蛋白,显著高于正常对照者(438.6 ± 70.2 U/mg蛋白)。应用丝氨酸蛋白酶抑制剂FUT-175预先孵育IBS-DFSN则可显著抑制其升高的总蛋白酶活性。此结果证实IBS-D患者粪便上清中升高的蛋白酶活性主要依赖于丝氨酸蛋白酶。2. IBS-D患者粪便上清诱导Caco-2细胞BDNF mRNA和蛋白表达升高Caco-2细胞BDNF mRNA表达在IBS-D FSN刺激后显著升高。而FUT-175预处理的IBS-D FSN组BDNF mRNA表达明显受到抑制。与mRNA结果一致,ELISA检测BDNF蛋白表达在IBS-D FSN刺激后同样显著升高,FUT-175则同样明显抑制IBS-D FSN对BDNF蛋白表达的诱导作用。3.PAR-2基因沉默显著抑制IBS-D粪便上清对Caco-2细胞BDNF表达的诱导作用PAR-2受体在IBS-D FSN刺激后表达显著高于对照FSN组,为进一步探讨PAR-2受体激活是否参与IBS-D FSN对BDNF表达的诱导过程,我们应用脂质体介导RNA干扰瞬时沉默PAR-2基因在Caco-2的表达。结果显示PAR-2基因沉默对Caco-2 BDNF的基础表达无明显影响,但却显著抑制IBS-D FSN对Caco-2细胞BDNF表达的上调作用。4. p38 MAPK通路蛋白参与IBS-D粪便上清液诱导的Caco-2细胞BDNF过表达为进一步研究PAR-2介导BDNF表达的下游通路,我们检测了MAPK p38和NF-κB p65两个PAR-2受体下游通路蛋白。结果显示IBS-D FSN能够快速诱导p38MAPK磷酸化增加,但对p65蛋白无明显影响。PAR-2抑制剂ENMD-1068可阻断IBS-D FSN对p38磷酸化的诱导。p38 MAPK抑制剂SB203580可阻断IBS-DFSN对Caco-2细胞BDNF蛋白的上调,但NF-κB抑制剂PDTC则无此作用。5.结直肠灌注IBS-D粪便上清液可诱导C57小鼠结肠高敏感,其作用依赖于结肠PAR-2激活和BDNF的过表达Western blotting结果显示,与对照FSN相比,结肠灌注IBS-D FSN可显著上调小鼠结肠上皮BDNF蛋白的表达,且此作用可被FUT-175和ENMD-1068抑制。免疫组化验证了Western blotting结果,显示上调的BDNF主要分布于结肠上皮和粘膜。功能上,腹壁肌电记录显示结直肠灌注生理盐水和对照FSN对小鼠结肠敏感性没有明显影响,IBS-D FSN可则显著增强小鼠对CRD的腹壁肌电反应。阻断BDNF或PAR-2,以及消除IBS-D FSN丝氨酸蛋白酶活力均显著抑制IBS-D FSN对结肠高敏感的诱导作用。第二部分1.研究对象基本情况连续纳入符合罗马III诊断标准的IBS患者30例和正常对照者30例。IBS患者腹痛程度和腹痛频率评分均显著高于对照组,IBS亚型之间无明显差异。IBS-D患者粪便上清(IBS-DFSN)丝氨酸蛋白酶活力为明显高于正常对照(median (IQR) 1521(905.3-1983) U/mg蛋白vs.465 (264.3-708.0) U/mg蛋白；P0.0001)。丝氨酸蛋白酶抑制剂抑肽酶(aprotinin)显著降低IBS-D FSN丝氨酸蛋白酶活力(245(109.8-413.5)U/mg蛋白；P0.001)。而IBS-C FSN丝氨酸蛋白酶活力(455(253-905.5)U/mg蛋白)与对照无明显差异。2. BDNF及其受体TrkB与肠胶质细胞(EGC)在肠粘膜分布紧密相关免疫组化染色显示结肠BDNF主要分布于结肠上皮细胞和粘膜固有层间质细胞,EGC标记物GFAP主要分布于上皮下的粘膜固有层间质。免疫荧光双标显示TrkB受体和GFAP存在共位表达,提示EGC表达TrkB受体；TrkB受体和神经纤维标记物PGP9.5也存在部分共位表达,表明神经纤维也表达TrkB受体。GFAP和PGP9.5免疫荧光双染显示GFAP与PGP9.5紧密相邻,并行,部分存在直接接触,表明EGC与肠粘膜神经纤维空间分布关系紧密,为二者可能存在相互作用提供了解剖学基础。3.IBS患者结肠粘膜BDNF, TrkB, GFAP表达升高在本研究群体中,免疫组化和western blotting再次验证了IBS患者结肠BDNF表达显著高于对照者,与我们之前发表另一IBS研究群体的研究结果一致。Western blotting显示IBS结肠粘膜总GFAP和TrkB蛋白表达水平显著高于正常对照。免疫荧光双标统计显示EGC特异表达的TrkB也显著高于对照组。而IBS-D组和IBS-C组这些蛋白的表达无明显差异。以上数据提示IBS患者增高的肠粘膜BDNF可能能够通过激活EGC发挥致痛作用。4.IBS患者结肠肠胶质细胞(EGC)伴有显著的超微结构改变为了阐明EGC在IBS是否存在异常激活,我们进一步应用透射电镜对IBS患者结肠EGC进行超微结构的观察,评价其亚细胞水平的改变。电镜结果显示IBS患者EGC异染色质明显减少,此为转录激活的信号；线粒体数目明显增多；糖原颗粒明显增多；镜下粗面内质网及多核糖体经肉眼观察也多于对照。以上数据提示IBS患者存在EGC功能异常活跃。5.IBS患者结肠肠胶质细胞表达P物质升高我们首次在人肠粘膜中检测SP在EGC中的表达。免疫荧光双标显示IBS患者结肠EGC内存在SP的表达,且其表达量相比对照明显增多。6. GFAP与SP表达与IBS腹痛评分显著相关为进一步分析EGC和IBS腹痛的关系,我们应用Spearman相关性分析法发现GFAP与SP均与IBS患者腹痛严重性评分和频率评分具有显著正相关性。第三部分1. IBS-D FSN诱导的内脏高敏感小鼠结肠过表达BDNF, GFAP, TrkB和SP我们选利用第二部分研究中收集的IBS-D FSN进行小鼠结肠灌注成功建立小鼠内脏高敏感模型后,检测结肠BDNF, TrkB和GFAP蛋白表达。Western blotting发现模型组小鼠BDNF, GFAP和TrkB蛋白的表达量显著高于对照FSN组和抑肽酶预处理的IBS-D FSN组。免疫荧光双标染色检测模型组和对照组结肠粘膜总SP和EGC特异表达的SP的表达量均显著高于对照FSN组和抑肽酶预处理的IBS-DFSN组。2. BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN对小鼠内脏高敏感的诱导作用为进一步从反面验证BDNF是否与EGC的激活相关以及BDNF水平降低后是否能阻断IBS-D FSN对内脏高敏感的诱导,我们应用BDNF基因敲除杂合子小鼠(BDNF+/-)作阴性对照,发现BDNF+/-小鼠接受IBS-D FSN结肠灌注后EMG反应显著低于野生小鼠。BDNF半量敲除后对小鼠基础内脏敏感性有一定影响,此影响在轻度的结肠扩张刺激下(60 mmHg)不明显,而在较重度(≥60 mmHg)的结肠扩张刺激下比较明显。以上结果提示IBS-D FSN诱导的内脏高敏感与BDNF表达水平密切相关。3. BDNF基因敲除抑制IBS-D FSN对小鼠结肠BDNF, GFAP, TrkB和SP表达的上调为进一步明确结肠EGC的激活是否依赖BDNF的表达,我们以BDNF+/-小鼠为对照,对比检测IBS-D FSN和对照FSN结肠刺激后GFAP, TrkB以及SP表达的差异。Western blotting结果显示,在BDNF+/-小鼠,IBS-D FSN刺激组和对照FSN刺激组GFAP和TrkB蛋白表达水平没有显著差异；同时,这两组与野生小鼠对照FSN组的GFAP和TrkB蛋白表达水平也没有显著性差异,但却明显低于野生小鼠IBS-D FSN刺激组。免疫荧光双标染色显示BDNF+/-小鼠IBS-D FSN刺激组和对照FSN刺激组结肠总SP和EGC特异表达的SP表达量均无明显差异,但SP在两刺激组EGC的表达量相比野生小鼠降低。以上结果提示EGC中GFAP以及SP的表达均依赖于BDNF的表达水平,表明EGC的激活很可能依赖BDNF相关的信号通路。4.氟代柠檬酸诱导的肠胶质细胞功能障碍抑制IBS-D FSN对内脏高敏感的诱导及SP的表达为了进一步验证EGC激活对内脏敏感性的直接作用,我们应用氟代柠檬酸介导的EGC功能障碍小鼠模型观察其对IBS-D FSN结肠刺激的反应变化,发现氟代柠檬酸显著抑制IBS-D FSN对野生小鼠内脏敏感性的上调作用。免疫荧光双标染色发现尽管GFAP表达没有受到明显影响,SP在EGC的表达却显著减少,并且IBS-D FSN刺激无法诱导SP在EGC的表达增加。以上结果表明,EGC很可能通过释放SP直接参与IBS-D FSN对小鼠内脏高敏感的诱导过程。5.重组人BDNF (r-HuBDNF)体外通过TrkB-PLCγ1通路直接激活肠胶质细胞为获得BDNF激活EGC的直接证据,我们进一步在体外应用EGC细胞系,研究人重组BDNF (r-HuBDNF)对大鼠肠胶质细胞的直接作用。Western blotting显示r-HuBDNF可显著上调GFAP,磷酸化的PLCγ1 (p-PLCγ1), TrkB以及SP的表达,BDNF竞争性拮抗剂TrkB/Fc预处理细胞则可完全阻断r-HuBDNF对GFAP, p-PLCγ1, TrkB以及SP的上调作用；PLCγ1抑制剂U73122可显著抑制GFAP的表达,PLCγ1的磷酸化水平,以及SP的释放,但对TrkB蛋白的表达没有明显作用。以上数据表明BDNF可直接激活EGC表达SP,且这一过程依赖于TrkB-PLCγ1的介导。6. r-HuBDNF激活的EGC培养液上清而非r-HuBDNF本身可诱导肠系膜感觉传入神经的放电反应为进一步验证r-HuBDNF刺激的EGC对肠感觉传入神经是否具有直接兴奋性或致敏作用,我们应用r-HuBDNF刺激的EGC培养液上清刺激离体的大鼠空肠肠系膜神经,观察神经放电频率的的变化。对照EGC培养液上清刺激后,神经放电频率与刺激前基础放电率没有明显差异。r-HuBDNF对神经放电没有明显影响,提示r-HuBDNF本身并不能诱发神经放电反应。r-HuBDNF (50～200 ng/ml)刺激的EGC培养液上清可明显诱发神经放电。应用PLCγ1抑制剂U73122或BDNF竞争性拮抗剂TrkB/Fc预处理EGC后的培养液上清则无法诱发肠系膜神经放电增加。应用SP特异性拮抗剂FK888预处理肠系膜神经以阻断SP受体NK1,发现活化的EGC培养液上清诱导神经放电频率相比未进行预处理时显著下降,但仍高于基础放电水平,提示SP在EGC对感觉神经兴奋过程中起重要作用。综合以上数据,我们推断r-HuBDNF激活的EGC可显著增加肠系膜感觉传入神经的兴奋性放电,并且EGC中SP的释放在这一过程中发挥重要作用。7. r-HuBDNF能够增强肠系膜传入神经的机械敏感性,且此作用可被激活的EGC协同性增强最后,我们进一步探讨r-HuBDNF及其激活的EGC对肠系膜神经机械敏感性的作用。r-HuBDNF激活的EGC培养液上清对大鼠空肠肠系膜神经的机械敏感性增强作用最明显,r-HuBDNF能够中等程度的增加肠系膜神经的机械敏感性,但幅度小于r-HuBDNF激活的EGC培养液上清。应用TrkB拮抗剂预处理肠系膜神经可部分抑制r-HuBDNF激活的EGC培养液上清对机械敏感性的增强作用,而应用TrkB拮抗剂和NK1拮抗剂共同预处理肠系膜神经则可显著抑制r-HuBDNF激活的EGC培养液上清对机械敏感性的增强作用。综上,我们的研究结果表明尽管r-HuBDNF自身不能直接诱发肠系膜神经放电,却能够诱导肠系膜传入神经的机械敏感性增加。激活的EGC也能够通过释放包括SP在内的神经兴奋性物质显著增加肠系膜传入神经的机械敏感性,因此我们认为r-HuBDNF和激活的EGC对肠系膜传入神经的机械敏感性具有协同性增加作用。结论第一部分1. IBS-D粪便上清对肠上皮细胞BDNF的基因表达具有显著促进作用,并通过PAR-2-p38 MAPK信号通路激活肠上皮细胞BDNF的表达,且此作用依赖于粪便上清中升高的丝氨酸蛋白酶活性。2. IBS-D粪便上清可体内诱导结肠高敏感,且此过程依赖于结肠上皮PAR-2受体的激活和BDNF表达增高。第二部分1.IBS患者结肠粘膜EGC可能存在激活,表现为GFAP表达增加以及兴奋性神经递质SP的表达增多。2.IBS患者结肠粘膜BDNF, EGC以及传入神经末梢密切相关,可能存在相互作用的增强。3. BDNF及其相关的EGC改变与IBS患者腹痛症状具有正相关性。第三部分1.结肠BDNF过表达可增强肠感觉传入神经的化学和机械敏感性,但本身不能诱发神经兴奋性放电。2.结肠BDNF过表达可直接激活EGC,诱导其释放SP。3.激活的肠胶质细胞通过释放SP增强肠感觉传入神经的化学和机械敏感性,同时也可直接增加神经自发放电,并和BDNF协同促进IBS内脏高敏感的发生。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.4

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