地皮菜水应激蛋白的制备及其抗结肠癌效应研究

发布时间：2020-07-31 09:06

【摘要】：结肠癌是发达国家的常见恶性肿瘤,也是我国常见的九大恶性肿瘤之一。在过去的30多年时间里,随着发展中国家城市化水平的进程,包括我国在内的多数国家或地区结肠癌发病率呈上升趋势。近十年来,随着手术、放疗和化疗的进步,早中期结肠癌治疗效果有了明显提升。然而手术仅对未转移肿瘤的治疗效果好,中晚期肿瘤采用放疗5年生存率低于15%,采用化疗5年生存率更低,这主要是由于肿瘤的复发和转移。化疗药物在杀伤恶性肿瘤细胞的同时,对机体的正常细胞有不同程度的毒副作用及耐药性。因此,从天然产物中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物一直是研究者关注的焦点。地皮菜,拉丁名为Nostoc commune Vauch.,别名地耳、地踏菇、地衣、地木耳、地软等,在我国各地都有分布。地皮菜是可以食用的一种蓝藻,营养丰富,含有人体所必需的八种氨基酸,蛋白质、VC、铁、钙等的含量甚至超过了木耳和银耳,具有重要的保健和医疗的重要价值。本研究以地皮菜为原料,利用生物化学技术从地皮菜蛋白粗提液中获得了单一的抗肿瘤活性蛋白组分,经质谱鉴定属于水应激蛋白(water stress protein,WSP)家族,命名为WSP1。应用细胞及裸鼠模型,从细胞增殖、细胞周期阻滞、细胞凋亡及细胞迁移等方面,研究了WSP1抑制结肠癌细胞生长和迁移的分子机制。此外,采用重组基因工程技术,将地皮菜水应激蛋白经原核表达系统表达纯化,鉴定了所获重组蛋白(Re-WSP1)的氨基酸序列和抗肿瘤活性。主要研究内容及结果如下：(1)采用丙酮沉淀和硫酸铵沉淀法制备地皮菜粗蛋白,得到单一的蛋白组分。经MALDI-TOF/MALDI-TOF/TOF质谱鉴定和基因序列分析,确定该蛋白组分为水应激蛋白,命名为WSP 1 (water stress protein 1, WSP 1)。(2)采用MTT法分析WSP1对人结肠癌细胞株DLD1、HCT116、SW480、HT29和人正常结肠上皮细胞株FHC增殖的影响。结果表明,WSP1抑制了结肠癌细胞的增殖,对正常结肠上皮细胞无显著作用。分子机制研究显示,WSP1通过下调c-Myc, cyclinD1, cyclinE1和p-Rb的表达水平,引起结肠癌DLD1细胞周期在G1期阻滞,导致细胞生长抑制。采用DAPI染色法和Annexin V/碘化丙啶双染法检测WSP1处理对细胞凋亡的影响。结果显示,WSP1处理后,DLD1和HCT116细胞核出现典型的凋亡小体,并且其早期凋亡率显著高于对照组,表明WSP1能够靶向诱导结肠癌细胞凋亡。(3)通过检测线粒体膜电位和caspase家族蛋白的表达量,进一步确定了WSP1诱导凋亡的分子机制。结果表明,经WSP1处理后,促凋亡蛋白Bax表达上调、抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,DLD1细胞的线粒体膜电位显著下降；caspase-8、caspase-9和caspase-3被显著激活,caspases的切割底物DNA修复酶PARP降解。加入广谱caspase抑制剂z-VAD-FAK后,WSP1诱导的细胞凋亡被明显逆转。(4)采用细胞划痕法检测了WSP1对DLD1和FHC细胞迁移的影响。结果显示,WSP1能够显著抑制结肠癌DLD1细胞的迁移,而对正常结肠上皮细胞FHC无显著影响。进一步研究表明,WSP1首先抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,诱导DLD1细胞发生自噬；激活的自噬进一步导致β-catenin降解及其下游效应分子的表达改变,最终引起DLD1细胞发生间质-上皮转化(Mesenchymal-Epithelial Transition, MET)。采用自噬的特异性抑制剂氯喹检验上述结果,所得数据表明,WSP1诱导的自噬是WSP1抑制细胞迁移的关键路径。(5)通过PCR技术,从地皮菜中得到WSP1的基因,序列号为KF003026。利用重组基因工程技术,将WSP1基因克隆到原核表达系统,获得了表达工程菌。经亲和纯化浓缩获得重组水应激蛋白(recombinant water stress protein, Re-WSP1)。结果显示,Re-WSP1对结肠癌SW480细胞的生长具有显著抑制作用,与从地皮菜中获得的天然水应激蛋白具有相同的生物活性。因此,Re-WSP1的研究可以为天然水应激蛋白抗癌药物的研发奠定基础。(6)用结肠癌DLD1细胞建立了裸鼠皮下成瘤模型,通过腹腔注射的方法,定期进行WSP1给药处理(共6次)。结果显示,WSP1处理裸鼠能够显著抑制结肠癌肿瘤的生长。采用免疫组化的方法对肿瘤组织中与细胞增殖、凋亡和迁移的相关指标进行检测,包括Ki-67、caspase-8、caspase-9、PARP、β-catenin、E-cadherin和N-cadherin,其结果与细胞实验结果一致。本研究结果显示,WSP1通过诱导结肠癌细胞发生G1期阻滞而抑制其增殖；经caspase依赖的途径诱导结肠癌细胞发生凋亡；通过诱导自噬抑制β-catenin介导的EMT来抑制结肠癌细胞的迁移；裸鼠模型结果与细胞实验实验结果一致；重组水应激蛋白具有与天然水应激蛋白一样的生物活性。因此,WSP1有可能作为一种有效的天然抗肿瘤药物进行深度开发和利用。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943

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