应用磁靶转染神经营养因子-3基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤模型的实验研究

发布时间：2020-09-02 08:41

　　脊髓损伤是临床上较常见的而且非常严重的神经系统创伤性疾病,常常导致严重的运动和感觉功能障碍,而且目前临床上尚无行之有效的治疗方法。骨髓间充质干细胞的移植治疗结合基因疗法是当前脊髓损伤治疗研究的热点。在脊髓损伤后,神经营养因子在神经修复中起着非常重要的作用。为了探索一条脊髓损伤治疗的新途径,我们的研究将包含神经营养因子-3基因通过慢病毒转染骨髓间充质干细胞,并在用超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞后,经蛛网膜下腔移植到体内,使其在体内能稳定表达神经营养因子-3,同时在移植后,利用磁场的作用靶向传送移植的干细胞到病变区,以加速干细胞向病变区的趋化运动的速率和增加干细胞在病变区的数量,从而使骨髓间充质干细胞的神经修复的作用得到加强、效率得到提高,进一步促进功能恢复,提高治疗效果。同时,我们还能借助MRI观察移植的磁标干细胞在体内的分布。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、传代、鉴定目的：使用全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,将提取的细胞经传代培养后,并从细胞的形态、表面抗原及增值能力方面进行鉴定,为实验提供细胞来源。方法: 1.采用全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,并对获得分离的细胞进行传代培养,同时对细胞形态进行观察。2.用MTT法测定分离的细胞的生长曲线,对其生长规律进行分析。3.用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面标志物(CD29、CD34、CD44、CD45),以鉴定所培养细胞是否具有骨髓间充质干细胞的特征。结果: 1.经全骨髓贴壁法分离纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,呈长梭形,在体外可以培养、传代。2.经MTT法测定第3、4、5代细胞的生长曲线呈S型,且形态相似,具有较强的增殖能力。3.经流式细胞仪检测细胞的表面标记志物,细胞表面的CD29和CD44表达呈阳性,CD34和CD45表达呈阴性,这符合一般骨髓间充质干细胞的特征。结论：应用全骨髓贴壁法可以分离纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,该法操作简单、经济实用、提取率高。所获得的细胞生长增殖旺盛、可进行连续多次传代,可以满足研究使用。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的神经营养因子-3基因转染和超顺磁性氧化铁颗粒标记目的：利用慢病毒将神经营养因子-3转导入骨髓间充质干细胞,使其能稳定表达神经营养因子-3,同时用超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞,为脊髓损伤的细胞移植治疗做准备。方法: 1.首先通过重叠PCR扩增att B1-NTF3-att B2,然后利用Gateway技术构建p Down-NTF3,利用Gateway技术构建包含神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)及红色荧光蛋白(red fluorescent protein,Ds Red)基因的质粒p LV.EX3d.P/puro-EF1αNTF3IRES/Ds Red Express2,最后进行慢病毒包装。2.利用慢病毒对骨髓间充质干细胞转染NT3-Ds Red基因。3.实时荧光定量PCR检测转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞的NT3 m RNA的表达。4.Western blotting检测转染NT3-Ds Red基因后的骨髓间充质干细胞的NT3蛋白的表达。5.利用浓度为25μg/ml的超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron oxide,SPIO)颗粒标记NT3-Ds Red基因转染的鼠骨髓间充质干细胞,然后用普鲁士蓝染色检测细胞的标记率。结果: 1.构建的包含NT3-Ds Red基因的质粒p LV.EX3d.P/puro-EF1αNTF3IRES/Ds Red Express2经测序检验完全正确,并能够成功转染293FT细胞,包装好的慢病毒滴度约为1.4×108TU/ml。2.成功转染NT3-Ds Red基因后的骨髓间充质干细胞荧光显微镜下可以观察到红色荧光。3.实时荧光定量PCR检测显示转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞的NT3 m RNA表达水平是未转染NT3基因的骨髓间充质干细胞的13倍。4.Western blotting检测结果显示转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞可以高表达NT3蛋白,而未转染NT3基因的骨髓间充质干细胞则不能表达。5.普鲁士蓝染色显示,浓度为25μg/ml的SPIO成功标记转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞,胞质蓝染,胞核呈淡红色,标记率100%。结论：构建的含NT3-Ds Red基因的慢病毒载体,能够将NT3-Ds Red基因转移并整合入鼠BMSC的DNA中,并使其高效、稳定地表达NT-3因子。同时浓度为25μg/ml的SPIO能够有效的标记转染NT3-Ds Red基因的骨髓间充质干细胞。为进一步的活体实验奠定了基础。第三部分磁靶向NT3基因转染的BMSCs治疗大鼠脊髓损伤的疗效评价和核磁共振活体成像目的：经蛛网膜下腔途径将超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron oxide,SPIO)标记的NT-3基因转染的BMSCs移植入大鼠脊髓损伤模型,然后利用磁场的作用靶向移植的细胞进入脊髓损伤区,并观察损伤的脊髓组织的修复和大鼠后肢运动功能的恢复情况,以评价治疗效果。同时利用磁共振(magnetic resonance,MR)对移植细胞进行活体成像,以观察细胞在体内的分布情况。方法: 1.于T10水平行椎板切开术,暴露硬脊膜囊,使用垂直撞击法建立SD大鼠脊髓损伤模型。2.造模成功7天后,36只大鼠被随机分成3组:①BMSCs组,12只,蛛网膜下腔移植转染Ds Red基因的BMSCs;②NT3组,12只,蛛网膜下腔移植SPIO标记的转染NT3-Ds Red基因的BMSCs;③M-NT3组,12只,蛛网膜下腔移植SPIO标记的转染NT3-Ds Red基因的BMSCs,并在细胞移植后,于大鼠的背部脊髓损伤水平外置磁铁24小时后,移除磁铁。3.移除磁铁后,进行MR成像,以观察细胞在体内的分布情况。4.细胞移植后1、3、7、14、2l、28、35天,参照BBB分级法(Basso,Beattie,Bresnahan locomotor rating scale,BBB)对所有大鼠后肢运动功能进行评分并记录。5.各组大鼠急性脊髓损伤模型,于细胞移植后的第35天,完成运动功能评分后,所有实验大鼠被安乐死,获得损伤的脊髓组织,通过Western blotting检测脊髓组织NT-3蛋白表达水平,HE染色观察损伤脊髓的囊性空洞大小,普鲁士蓝染色检测SPIO标记的细胞,免疫组化染色评估神经丝蛋白(neurofilament-200,NF200)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达。6.所有的数据采用均值(x—)±标准差(SD)来表达,BBB评分结果分析采用重复测量方差分析,其它数据分析采用单因素方差分析,p值小于0.05,认为有统计学差异。数据分析采用统计软件SAS 6.12和SPSS 17.0进行统计分析。结果: 1.移植骨髓间充质干细胞后的急性脊髓损伤的大鼠的MR成像结果显示,M-NT3组和NT3组的脊髓损伤处的T2*WI图像的信号强度明显下降,其中以M-NT3组下降最多,而BMSCs组未见明显下降。2.各组急性脊髓损伤的大鼠的BBB评分结果显示,在细胞移植后的第1、3天,各组的BBB评分之间无明显统计学差异(n=12,p0.05),但是在细胞移植治疗后的第7、14、21、28、35天,M-NT3组的BBB评分在三组之中最高,而NT3组的BBB评分也明显高于BMSCs组,这些时间点的三组的BBB评分经重复测量方差分析,差异有统计学意义(n=12,p0.05)。3.在细胞移植治疗后的第35天,各组损伤的脊髓表达的NT3蛋白的经Western Blotting分析显示,M-NT3组的NT-3蛋白的表达水平要明显高于NT3组和BMSCs组,而BMSCs组的NT-3蛋白的表达水平则明显低于M-NT3组和NT3组,三组的NT3蛋白表达水平经单因素方差分析,差异有统计学意义(n=12,p0.05)。4.在细胞移植治疗后的第35天,各组脊髓损伤区的普鲁士蓝染色显示,M-NT3组的蓝染细胞数量明显多于NT3组,而BMSCs组未观察到任何蓝染细胞。5.在细胞移植治疗后的第35天,各组损伤的脊髓的HE染色显示,BMSCs、NT3和M-NT3组脊髓损伤区囊性空腔面积(x—±SD)分别为:0.64±0.14 mm2、0.51±0.11 mm2、0.39±0.10 mm2,经单因素方差分析,差异有统计学意义(n=12,p0.05)。6.在细胞移植治疗后的第35天,各组损伤的脊髓的免疫荧光染色显示,三组中,NF200表达水平在M-NT3组的最高,在BMSCs组最低,而GFAP在M-NT3组的最低,在BMSCs组最高,三组的NF200和GFAP表达水平分别经单因素方差分析,差异有统计学意义(n=12,p0.05)。结论：通过磁靶向移植SPIO标记的NT3基因转染的骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤,不但可以明显提高细胞归巢效率,还能够明显减小脊髓损伤区囊性空腔的面积、促进轴突再生、抑制胶质瘢痕形成和增进功能恢复。同时,还可以通过磁共振对移植的骨髓间充质干细胞进行活体成像,观察细胞在体内的分布情况。这种脊髓损伤的治疗方式是一种高效的、微创的治疗方法,非常具有临床应用前景。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R651.2;R-332

【参考文献】