非创伤性股骨头坏死中CD41-缺乏的外泌体对间充质干细胞成骨和迁移的损伤作用

发布时间：2020-10-30 10:36

　　 背景:非创伤性股骨头坏死(Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一种骨科常见的致残性疾病,其发病率较高,且好发于20-50岁的青壮年。激素的使用是ONFH的常见且明确的致病因素,然而,激素导致该疾病的机制目前尚不清楚。近年来,干细胞移植已被用于ONFH的治疗,且已经取得了一定的效果,但是,移植进去的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化和迁移能力降低,从而导致该治疗的失败率居高不下。另外,我们发现当去除其致病因素后,该疾病仍然持续进展。因此,我们推测股骨头坏死骨组织似乎在释放某种信号影响骨组织内正常的MSCs以及移植的健康MSCs的修复作用。外泌体是一种新发现的细胞间信号传递方式,是一种细胞外囊泡,具有双层膜结构。由于外泌体的双层膜具有保护作用,使得外泌体内的信号分子更稳定,传递范围更广,影响更强。因此,我们推测,ONFH骨微环境中的外泌体可能损害了MSCs的修复作用。然而,关于股骨头坏死组织内外泌体损伤MSCs的修复作用尚未见相关报道。因此,我们分别从细胞、人体组织、动物模型三个层面分别探索了ONFH外泌体的作用,并对其致病机制做了简单的尝试。目的:本研究通过提取ONFH骨组织外泌体,分别探讨其对MSCs的成骨分化、迁移的影响并证明ONFH骨组织来源外泌体(ONFH-derived exosomes,ONFH-exos)的致病作用;探讨ONFH骨组织外泌体蛋白谱的变化并找到其致病的关键分子;寻找ONFH骨组织外泌体的致病机制;验证正常骨组织外泌体对地塞米松处理的MSCs的成骨分化和迁移修复作用,以及对ONFH的治疗作用。方法:用超速离心法从骨组织提取外泌体,并使用透射电镜、纳米粒子示踪分析以及外泌体标志蛋白检测对其鉴定。用ONFH-exos处理S-D大鼠,然后通过mcro-CT以及组织学切片检测该外泌体的体内作用。用ONFH-exos处理人原代间充质干细胞(primary human mesenchymal stem cells,HMSCs)以及C3H10T1/2细胞,用Western blotting和茜素红染色试验检测两种细胞的成骨分化作用;用划痕实验检测细胞的迁移作用;用CCK-8以及流式细胞术检测细胞的增殖作用;用流式细胞术检测细胞的凋亡。然后,用Itraq联合TOF-LC-MS/MS分析ONFH-exos蛋白质谱,鉴定差异蛋白;通过生物信息学分析,找到其中与成骨和分化相关的关键分子;用Western blotting和划痕实验,验证该分子的作用以及寻找其相关通路。最后,用micro-CT和组织学检查验证正常外泌体对S-D大鼠股骨头坏死样改变的预防作用。结果:通过尾静脉注射ONFH-exos,能够导致S-D大鼠发生股骨头坏死样改变。ONFH-exos能够被HMSCs和C3H10T1/2细胞摄取,并能抑制成骨分化指标如:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),骨钙素(bone gla protein,BGLAP),Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COLⅠ),骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,并能抑制钙盐沉积。通过划痕实验,发现ONFH-exos可以抑制HMSCs和C3H10T1/2细胞的迁移。通过蛋白组学分析发现了64种改变明显的差异蛋白,并最终根据生物信息学和文献报道,发现了整合素α2b(Integrinα2b,CD41)可作为关键分子。并证明了由于缺乏CD41,ONFH-exos可以引起HMSCs和C3H10T1/2细胞成骨分化和迁移能力的降低导,在此过程中,CD41/整合素β3-FAK-PI3K/Akt-Runx2通路起到了重要作用。而富含CD41的正常骨组织外泌体可促进HMSCs和C3H10T1/2细胞成骨分化和迁移,尾静脉注射富含CD41的正常骨组织外泌体可以防止S-D大鼠股骨头坏死样改变的发生。结论:股骨头坏死骨组织可以通过释放外泌体抑制间充质干细胞的分化和迁移,从而导致了干细胞移植的高失败率以及疾病的不可逆性。其主要原因可能是由于股骨头坏死外泌体中CD41含量的减低,同时,CD41/integrinβ3-FAK-PI3K/Akt-Runx2通路在此过程中,起到了重要的作用。富含CD41的正常外泌体可以通过促进间充质干细胞的分化和移植,有效防止了股骨头坏死的发生。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R681.8
【部分图文】：

综上所述,传统的治疗对ONFH无效,MSC移植的失败率高,而原因尚不清楚。我们的体内和体外实验结果均表明,坏死区骨组织来源的外泌体由于缺乏CD41,从而损害了MSCs的成骨分化和迁移而促进了ONFH的进展,且导致MSCs相关治疗无效。ONFH的CD41丰富的外泌体可以通过补充CD41激活CD41/整合素β3-FAK-Akt-Runx2通路防止GC诱导的大鼠ONFH样变化的发生。我们的研究证实了坏死区向间充质干细胞传递信号,损伤了间充质干细胞的修复能力。我们的发现是对ONFH发病机制的扩展,同时,探讨发掘出了富含CD41外泌体的潜在治疗价值。而CD41是否可以作为诊断标志物还有待进一步研究。此外,本研究也存在一些不足:首先,部分组织由于在液氮中储存时间较长(<1年),因此,这可能会导致部分组织中的外泌体的内容物或者功能发生改变。其次,本研究中,组织外泌体不是单一细胞来源的,而是多细胞来源的,因此,可能会给我们找到关键分子以及关键的细胞亚型带来困难。然后,尽管超速离心法是外泌体提取的金标准也是最常用的提取方法[53],但是这种方法会造成部分外泌体的破裂[54]。最后,本研究所纳入的病人样本量较小,因此,需要在更多的病人标本中加以验证。而且,本探讨对机制部分的探讨较浅,需要对此机制进行更深入的探讨。图2 ONFH和正常外泌体的表征和摄取实验

ONFH和正常外泌体的表征和摄取实验

ONFH-exos在S-D大鼠体内的效果
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本文编号：2862358