背景:侵袭性肺曲霉病是一种致死率较高的感染性疾病。急性白血病患者和造血干细胞移植曲霉菌感染患者的死亡率高达40%至50%。三唑类药物是目前临床上最主要的抗真菌药物,而曲霉菌对三唑类药物的耐药率逐年增加,使得临床上对曲霉菌感染的治疗陷入困境。免疫调节联合抗真菌治疗被认为是最有潜力的疾病改善措施,但目前尚未发现有效的作用靶点。Toll样受体7(TLR7)是一种位于细胞内的高度保守的固有免疫病原模式识别受体。TLR7最初被认为是识别病毒来源的单链RNA的受体。后有研究表明,除了病毒单链RNA外,TLR7还可以识别细菌释放的核酸。而还有研究显示,TLR7参与了白色念珠菌感染致病过程中免疫调节;且有临床研究表明,病人T淋巴细胞表面TLR7的表达水平与真菌感染呈负相关趋势。近期有临床研究报道TLR7的基因多态性与曲霉菌感染相关,但TLR7是否参与宿主抗曲霉菌感染的免疫反应过程尚未见报道。目的:本研究旨在明确TLR7在宿主抗曲霉菌感染免疫反应中的作用,阐明其发挥作用的机制,为开发曲霉菌感染的免疫治疗方法提供新思路。方法:选取实验室标准烟曲霉菌株AF293,经支气管给药的方式建立侵袭性曲霉菌肺部感染模型,Q-PCR检测TLR7在不同感染时间点小鼠标本中的mRNA表达水平。建立免疫正常及免疫抑制两种免疫状态下野生(WT)和TLR7缺陷(TLR7~(-/-))小鼠曲霉菌感染模型,通过生存率实验、肺曲霉菌载量测定,明确TLR7在曲霉菌感染中作用;并通过外源性给予小鼠TLR7特异性激动剂咪喹莫特(imiquimod,R837)处理,再次观察小鼠生存率,验证TLR7在曲霉菌感染中的作用。通过肺组织病理切片HE染色、PAS染色以及检测肺干湿比、支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白水平,明确TLR7在曲霉菌感染后小鼠肺损伤中作用。采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分类计数WT和TLR7~(-/-)曲霉菌感染小鼠BALF中炎症细胞,采用ELISA检测肺部炎症细胞因子和趋化因子的表达水平,明确TLR7在曲霉菌感染中的免疫调控效应。分离培养在天然免疫抗菌防御中发挥重要作用的巨噬细胞和中性粒细胞,在体外通过吞噬杀伤实验,评价TLR7对免疫细胞吞噬杀伤曲霉菌孢子功能的影响,明确TLR7在曲霉菌感染中发挥免疫调控作用的机制。通过巨噬细胞敲除实验,明确巨噬细胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中的作用。结果:1.TLR7在曲霉菌感染小鼠肺及脾组织中表达上调与对照组相比,在曲霉菌感染后12小时小鼠肺及脾组织中TLR7mRNA表达显著上调,差异具有统计学意义(肺p0.05,脾p0.01)。2.TLR7在侵袭性肺曲霉病中发挥有害作用1)生存率实验显示,正常免疫状态下,在高致死剂量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率显著提高(32%生存率,p0.001);在中等致死剂量的曲霉菌肺部感染模型中,WT小鼠全部死亡,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率显著提高(90%生存率,p0.001)。2)生存率实验显示,正常免疫状态下,在低致死剂量的曲霉菌感染WT小鼠中,与对照组相比,R837处理组小鼠全部死亡,生存率显著降低(降低30%,p0.05);在相同感染剂量的TLR7~(-/-)小鼠中,R837处理组小鼠及对照组小鼠生存率均为90%,TLR7~(-/-)小鼠生存率显著高于野生小鼠(p0.001),且当TLR7缺陷时,R837处理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p0.05)。3)生存率实验显示,免疫抑制时,经致死剂量的曲霉菌肺部感染后,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠生存率显著提高(提高54%,p0.01),与正常免疫状态的结果一致。3.TLR7缺陷使机体对曲霉菌的清除能力增强1)通过肺部病原载量分析,正常免疫状态下,曲霉菌感染后第1天及第3天,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺组织中真菌载量显著降低(p0.01),真菌清除能力增强;肺组织切片标本经糖原染色后,可见TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌孢子较WT小鼠少。2)通过肺部病原载量分析,免疫抑制时,曲霉菌感染后第3天,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺组织中真菌载量显著降低(p0.05),真菌清除能力增强,与正常免疫状态的结果一致。4.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺损伤减轻1)肺组织病理学切片HE染色结果显示,野生小鼠肺部出现严重坏死、肺泡结构破坏、上皮细胞脱落、出血和大量的炎症细胞浸润,TLR7~(-/-)小鼠病理损伤范围小,损伤较野生小鼠减轻。2)肺干湿比及BALF总蛋白检测结果显示,在感染后第1天,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠肺湿重/干重比值显著降低(p0.01),感染后第3天,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中总蛋白含量显著降低(p0.05)。5.TLR7缺陷使曲霉菌感染小鼠肺部炎症细胞募集减少1)通过牛鲍计数板计数BALF中的WBC数目发现,曲霉菌感染后3天,与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中白细胞总数显著减少(p0.05)。2)经FCM对BALF中白细胞分类计数发现,曲霉菌感染后3天,TLR7~(-/-)小鼠BALF中CD11b~+F4/80~+巨噬细胞比例增加(23%vs 14%),CD11b~+Ly6G~+中性粒细胞比例无显著差异。与WT小鼠相比,TLR7~(-/-)小鼠BALF中性细胞绝对值显著降低(p0.05),而巨噬细胞的绝对计数无显著差异。6.TLR7缺陷导致曲霉菌感染后炎症细胞因子水平显著降低而CCL2显著增高通过ELISA检测肺炎症细胞因子和趋化因子水平发现,与野生小鼠相比,在感染后1天,TLR7~(-/-)小鼠肺匀浆中,炎症细胞因子IL-6(p0.01)及中性细胞趋化因子CXCL1(p0.05)水平显著降低;在感染后3天,IL-17A水平显著降低(p0.05),巨噬细胞趋化因子CCL2表达显著上调(p0.05)。而其他细胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-27、IFN-a及IFN-γ)的水平无显著差异。7.TLR7缺陷使巨噬细胞吞噬杀伤功能增强但不影响中性粒细胞吞噬杀伤功能体外分离培养小鼠巨噬细胞和中性粒细胞,吞噬杀伤实验显示,来自TLR7~(-/-)小鼠的原代巨噬细胞与来自WT小鼠原代巨噬细胞相比,吞噬、杀伤孢子功能显著增强(p0.05),两组小鼠原代中性粒细胞吞噬、杀伤孢子功能无显著差异。8.巨噬细胞在曲霉菌感染宿主免疫防御中发挥重要作用生存率结果表明,与对照组相比,巨噬细胞敲除后WT小鼠生存率显著降低(降低约31%,p0.05)。结论:TLR7在侵袭性肺曲霉病动物模型中表达显著增高,并发挥了免疫损害作用。初步阐明了其作用机制,即TLR7通过抑制巨噬细胞的吞噬杀伤孢子功能,抑制机体清除曲霉菌孢子,进一步诱导炎症反应,促进炎症细胞募集,促进炎症因子及趋化因子的分泌,加重肺损伤,引起曲霉菌感染小鼠死亡率增高,TLR7~(-/-)小鼠曲霉菌清除作用增强,肺损伤减轻,生存率提高。这些结果提示,TLR7是一个良好的治疗曲霉菌感染的免疫干预靶点。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R519
【部分图文】：
为探究TLR7是否可在曲霉菌感染中发挥免疫调节作用,我们采用烟曲霉菌标准菌株AF293,经支气管滴注的方式,建立了侵袭性肺烟曲霉菌感染模型。分别于感染的0 h、6 h、12 h、24 h、72 h,收集小鼠肺及脾组织,提取RNA,经Q-PCR检测TLR7的mRNA水平,结果显示与PBS对照组相比,曲霉菌感染后6小时小鼠肺组织、脾组织中TLR7 mRNA表达显著上调(图1,肺p<0.05,脾p<0.001),提示TLR7可能在曲霉菌感染中发挥免疫调节作用。3.2 TLR7在曲霉菌感染中发挥免疫损害作用
为探索TLR7在曲霉菌感染中的作用,我们采用高致死剂量(1.25×108CFU/只)和中等致死剂量(1.05×108CFU/只)的曲霉菌分别建立侵袭性肺曲霉菌感染模型,在不同程度致死剂量下,分别建立WT和TLR7-/-小鼠曲霉菌感染模型后,观察小鼠14天生存率、小鼠状态和体重变化。结果显示:在高致死剂量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率为0%时,TLR7-/-小鼠生存率为31.82%,与WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率显著提高(p<0.001,图2.1 A);在中等致死剂量的曲霉菌感染模型中,WT小鼠生存率为0%时,TLR7-/-小鼠生存率为高达90%,与WT小鼠相比,TLR7-/-小鼠生存率显著提高(p<0.001,图2.1 B)。以上结果提示TLR7在曲霉菌性肺炎中发挥免疫损害作用。3.2.2 TLR7激动剂处理曲霉菌感染小鼠生存率显著降低
为了进一步验证TLR7在曲霉菌感染中的免疫损害作用,我们建立了低致死剂量(9.5×107CFU/只)曲霉菌感染模型,并采用TLR7激动剂R837(imiquimod)分别处理曲霉菌感染WT和TLR7-/-小鼠,PBS处理组为对照组。如图2.2所示,在曲霉菌感染的野生小鼠中,R837处理组小鼠生存率为0%,无内毒素H2O对照组生存率为30%,与对照组相比,R837处理组小鼠生存率显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05);在相同感染剂量的曲霉菌感染后的TLR7-/-小鼠中,R837处理组小鼠生存率为90%,无内毒素H2O对照组生存率为90%,TLR7-/-小鼠生存率显著高于野生小鼠(p<0.001),且当TLR7缺陷后,R837处理并未降低曲霉菌感染小鼠生存率(p>0.05)。以上结果从正向验证了TLR7在曲霉菌性肺炎中发挥免疫损害作用。3.2.3 TLR7缺陷显著提高免疫抑制状态下曲霉菌感染小鼠生存率
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本文编号：
2882785
