背景整体观是祖国医学基本哲学观,整体观哲学强调人是有机的整体,机体整体与局部在生理与病理中都存在相互联系及影响。近年来2型糖尿病与退行性腰椎管狭窄症之间的关系研究成为了现代医学的热门领域。祖国医学在早期亦介绍此全身影响性疾病消渴对局部腰痹病存在影响,并提示两者的媒介因素可能是血瘀。现代炎症反应概念是祖国医学血瘀内涵的重要部分之一,其也是结缔组织纤维化的重要环节。本课题在中医整体观理论指导下,通过现代实验技术探究全身性代谢性疾病2型糖尿病(属于消渴范畴)对脊柱局部常见的退行性腰椎管狭窄(属于腰痹病范畴)黄韧带肥厚的具体作用机制及中药在其防治方面的潜在价值研究。目的在中医整体观指导下,通过回顾性分析,探究全身性代谢性疾病2型糖尿病(属于消渴范畴)对局部退行性腰椎管狭窄(属于腰痹病范畴)患者中椎管内黄韧带等重要参数的影响;通过人体黄韧带组织检测及病理分析、体外实验研究,探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)及其相关的促纤维化炎症介质在黄韧带中含量、对应黄韧带病理学改变以及MIF对黄韧带效应细胞的促炎性机理,阐明血瘀理论概念下的炎症反应在两者之间的关系;根据“从瘀而治”理论,探讨活血化瘀中药姜黄有效成分姜黄素对MIF作用于成纤维细胞的干预效应。方法第一部分:在中医整体观指导下,回顾性分析中国人民解放军中部战区总医院3年来(2016年1月1日-2019年1月1日)诊断为退变性腰椎管狭窄症住院病人。在双盲前提下测量并对比合并2型糖尿病(DM+)与非合并2型糖尿病(DM-)两组人群之间在黄韧带厚度、下关节突间距、椎管有效腔隙矢状径方面的情况,研究两组人群之间是否存在差异性。第二部分:前瞻性设计:在2018年8月27日-2019年5月29日,结合诊断、纳入、排除标准,录入湖北六七二中西医结合骨科医院所有脊柱外科40例退行性腰椎管狭窄症手术患者。根据合并2型糖尿病与否分为DM+组和DM-组。40例患者中合并2型糖尿病20例(DM+组),其中男性8例,女性12例,平均年龄61.55±2.41岁,BMI:25.62±0.785,该组黄韧带来源L4/L5水平14例,L5/S1水平4例,L3/L4水平2例;非糖尿病患者20例(DM-组),其中男性11例,女性9例,平均年龄58.85±3.78岁,BMI:23.60±0.643,该组黄韧带来源L4/L5水平15例,L5/S1水平3例,L3/L4水平2例。术前根据Jong-Beom Park黄韧带测量方法在腰椎MRI水平面上测量手术节段黄韧带厚度。术中40例黄韧带样本完整取出后按左右侧分为a、b两份(a份干冰盒收集后冻存、b份予以甲醛固定),a份采用ELISA技术检测MIF及相关促纤维化炎症介质(TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-αMMP-13)含量;b份采用Masson染色及IHC染色后Image-Pro Plus 6.0软件对图片进行量化。运用影像、生化、统计方法来对比两组样本之间的差异。第三部分:采用NIH3T3细胞进行常规方法复苏、培养、传代(实验用3-5代)进行体外细胞实验。1.正常(5mM葡萄糖)与高糖(25mM葡萄糖)浓度刺激NIH3T3细胞48小时,Western Blot检测MIF的表达差异及镜下观察细胞增殖情况。2.引入外源性MIF(重组鼠巨噬细胞移动抑制因子,rmMIF),按浓度设置为N正常浓度对照组(2 ng/ml)、L低浓度组(4 ng/ml)、M中浓度组(10ng/ml)、H高浓度组(50 ng/ml)刺激NIH3T3细胞进行研究:(1)48h时间点光镜下观察比较不同浓度rmMIF对NIH3T3细胞增殖生长形态的影响;(2)分别在0、24、48、72h时间点予以CCK-8法检测对比四组之间A450值(酶标仪下450nm处的吸光度值);(3)48h流式细胞术检测比较成纤维细胞增殖S期情况。3.设置正常浓度rmMIF(2ng/ml)、高rmMIF浓度(50ng/ml)、高rmMIF浓度+Rho激酶特异性抑制剂Y27632三组刺激NIH3T3细胞48 h后运用RT-PCR及Western Blot法检测对比三组之间细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的m RNA与蛋白表达差异。第四部分:NIH3T3细胞体外实验,分组设计:A组(无处理组)、B组(刺激组)加rm MIF(50ng/ml)、C组(抑制剂组)加rm MIF(50ng/ml)+ISO-1(20μM)、D组(姜黄素组)加rm MIF(50ng/ml)+姜黄素(20μM)与DMEM培养液一并置37℃、5%CO2孵箱培养48 h,分别采用:(1)CCK-8检测法在48h对无处理组、刺激组、姜黄素组三组用酶标仪测450 nm处的吸光度值(A450值);(2)运用RT-PCR及Western Blot方法检测比较各组之间炎症介质(TGF-β1、MMP-13、IL-1β、IL-6、TNF-α)及胶原蛋白(COL-1、COL-3)的m RNA与蛋白表达差异。结果第一部分:通过测量与对比研究发现,合并2型糖尿病组(DM+)与非合并2型糖尿病组(DM-)黄韧带厚度为(5.23±0.71)mm vs(4.42±0.60)mm;下关节突间距为(11.32±1.23)mm vs(12.09±1.57)mm;椎管有效腔隙矢状径为(7.57±1.87)mm vs(8.24±1.74)mm;两组在此三种参数中存在统计学差异(P0.05)。第二部分:DM+组vs DM-组:黄韧带厚度为(5.567±1.090)vs(4.828±0.552)mm;MIF含量为(312.105±80.820)vs(210.363±62.182)pg/mg protein;TGF-β1含量为(2728.121±890.373)vs(2170.131±689.459)pg/mg protein;MMP-13含量为(564.167±189.391)vs(379.841±101.363)pg/mg protein;IL-1β含量为(15.585±5.797)vs(10.785±2.787)pg/mg protein;IL 6含量为(17.238±4.449)vs(12.523±2.842)pg/mg protein;TNF-α含量为(13.947±4.688)vs(9.829±2.616)pg/mg protein;Masson染色后的胶原纤维胶原容积分数为(50.354±9.762)vs(41.803±5.873);IHC中MIF阳性染色IOD为(2808.882±699.779)vs(1615.892±408.609)以上指标在两组之间差异有统计学意义(P0.05);IHC中MIF阳性染色棕色颗粒分布于黄韧带成纤维细胞细胞核、胞质内以及基质中,而且此病理现象在DM+组内更加明显。相关性分析显示:黄韧带内的MIF浓度与厚度呈正相关(r=0.768,P=0.000)。第三部分:1.相比于正常糖浓度,体外高糖浓度下培养的NIH3T3细胞对MIF蛋白的表达水平更高且48h时间点高糖浓度组NIH3T3细胞增殖明显。2.(1)光镜下可见同一时间点(48h)不同rm MIF浓度组间NIH3T3细胞生长呈现差异,rm MIF刺激浓度越高细胞密度越大;(2)CCK-8检测显示:正常、低、中、高rm MIF浓度组间A450值(48h)组间总体均数差异有统计学意义(P0.05),与正常浓度对照组相比,低、中、高rm MIF浓度组增殖活性高且差异有统计学意义(P0.05);(3)流式细胞术检测显示随rm MIF浓度增加各组内S期的细胞占比增多。3.rm MIF刺激NIH3T3细胞48 h后细胞Cyclin-D1的m RNA和蛋白表达增加,经Rho途径抑制剂阻滞后Cyclin-D1的m RNA和蛋白表达降低。第四部分:CCK-8检测显示:刺激组较无处理组A450值高(P0.05),姜黄素组较刺激组A450值降低(P0.05),姜黄素组与无处理组A450值无统计学差异(P0.05);RT-PCR及Western Blot检测显示:B刺激组较A无处理组各因子胶原m RNA及蛋白表达更高(P0.05);D姜黄素组较B刺激组的表达降低(P0.05);D姜黄素组与C抑制剂组间表达差异无统计学意义(P0.05)。结论1.合并2型糖尿病的腰椎管狭窄症患者人群中,黄韧带肥厚等3种参数退变程度明显高于非糖尿病患者,证实了2型糖尿病是腰椎管狭窄,尤其是黄韧带肥厚的易感因素。揭示全身代谢性因素可对腰椎局部产生影响,符合中医整体观理论;2.在2型糖尿病合并腰椎管狭窄患者的黄韧带内发现MIF及其相关的促纤维化炎症介质(TGF-β1、IL-1β、IL-6、TNF-αMMP-13)含量更高,其中MIF含量与黄韧带厚度呈正相关。在合并2型糖尿病组内黄韧带样本内存在更明显的弹力纤维降解及胶原纤维增生现象,而且该组人群MIF的含量高且在黄韧带中的分布更加广泛。3.高糖环境刺激成纤维细胞高表达的MIF可促进成纤维细胞增殖及炎性介质表达,MIF参与的炎症反应可能在介导合并2型糖尿病的腰椎管狭窄黄韧带肥厚病理过程中占主导地位,其中,MIF促进的成纤维细胞增殖及胶原纤维增生可能是黄韧带瘢痕修复致其肥厚的重要部分。炎症反应包括炎性损伤及修复两重要部分,其是中医血瘀理论的主要内涵之一;4.活血化瘀中药姜黄的有效成分姜黄素可有效地阻断MIF对成纤维细胞的相关炎性及促增殖效应,这表明姜黄可能是防治2型糖尿病合并腰椎管狭窄黄韧带肥厚的有效药物之一,值得进一步研究。以上研究进一步说明了中医整体观在分析合并2型糖尿病的腰椎管狭窄黄韧带肥厚机理中的重要指导作用,同时也有力地证明了血瘀是消渴影响腰痹病的重要媒介因素且活血化瘀药遵循中医“从瘀而治”理论可能是此类全身性慢性疾病并发腰椎黄韧带肥厚寻找有效干预方法的重要指导依据之一。
【学位单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R274.9
【部分图文】：
用邢文华与零刚新[13,14]描述的方法,两侧椎板交点c与椎体后缘中点d连线(椎管矢状径)上测量椎间盘后缘到两侧黄韧带交点前缘的距离。1.2.4测量及统计学方法
371名腰椎狭窄症患者中单节段狭窄144例,多节段狭窄227例,其中L1~S1每一节段狭窄具体分布如下:L1/L2 12例、L2/L3 70例、L3/L4193例、L4/L5 331例、L5/S1 88例(图1-2),L4/L5为研究人群的腰椎狭窄症发生率最高节段。在331例存在L4/L5水平狭窄的患者中合并2型糖尿病患者112例(DM+组)、非合并2型糖尿病患者219例(DM-组)。2.3 椎管内各参数对比结果
首先对拟行手术治疗的退行性腰椎管狭窄症患者及家属进行常规术前谈话,同时告知此次黄韧带试验内容获得知情同意并签字。患者全身麻醉后取俯卧位,腹部两侧软枕悬空。术前透视定位并标记手术节段后,进行常规消毒铺巾。后正中入路,切开皮肤、筋膜及深层肌肉韧带,在保留棘上韧带前提下,单极电刀棘突两旁骨膜下剥离结合双极电凝肌层止血,向下暴露椎板及椎板间隙,向外暴露至关节突外侧。与以往双侧TLIF减压的方式不同,为避免常规椎板咬骨钳撕扯钳咬影响黄韧带纤维的结构,取黄韧带标本时上、外、下侧止点尽量运用磨钻打薄从开槽止点处骨质后骨刀凿除止点,内侧止点适当牵开后用刀片沿棘突下由下向上切开取出。切除黄韧带上、下、外侧止点后以椎管穹隆为界将左右分两侧黄韧带各自整块取出,形态如蝴蝶翅膀(图2-1)。手术中取出后马上进行初步洗净、去除骨质及背侧附着软组织。左侧黄韧带标记为A(n)放入干冰盒内转入-80摄氏度保存,右侧标记为B(n)放入福尔马林溶液中固定。2 方法
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