雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长

发布时间：2020-11-14 05:18

　　 该博士论文由相对独立的两部分工作组成。第一部分雷帕霉素通过调节与自噬和肿瘤干细胞相关的通路抑制小鼠S180肉瘤生长背景:随着现代社会的不断发展,癌症在我国每年的新发病率呈上升趋势,同时死亡率也逐年增高,已经成为造成中国人口死亡的主要原因之一。我国幅员辽阔,人口数量庞大,约占世界总人口的20%左右,进入21世纪,出生率与死亡率比重逐步增大,在世界大环境下每年近有22%的新发恶性肿瘤患者以及27%的因为恶性肿瘤去世的患者。相应的恶性肿瘤治疗费用呈逐年增长趋势,已严重制约着社会的发展与进步。社会压力增加、环境污染、饮食模式趋向西方化、运动量减少、人口老龄化等多因素的叠加是导致发病率增加的主要原因。肉瘤的概念为起源于间充质成分的一组生物学表现比较特殊的瘤体,它是恶性肿瘤但是有别于我们常说的癌症。肉瘤的发病部位多位于表皮、皮下、骨组织、软组织、结缔组织等,肺内间质中也有肉瘤的发生,原发性肺肉瘤(primary pulmonary sarcoma,PPS)为来自于肺部比较不多见的呼吸系统的肉瘤,占国内肺部恶性肿瘤的0.7%～3.6%,肉瘤按照发病组织来源可分为平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维组织肉瘤、恶性间皮瘤等。肉瘤发病率虽低,但可以在任何年龄段发生,男性的患病人数比女性高,与肺癌、结直肠癌等常见癌症相比,发病人群趋于低年龄化的特点,在青年人、中年人中占的比重较高,其在发病的早期阶段容易发生血行转移,并且病情发展的速度快,生存质量不佳,对全身影响大,预后不佳。肉瘤对放疗和化疗不敏感,手术前后的辅助治疗在延长患者生存时间方面没有明显优势,外科干预的治疗方法还是对其比较有效的方式,做手术的目的就要尽最大努力对瘤体实现完整性切除,这对于预后有较大影响。因此,对肉瘤而言,靶向治疗是一种更加科学有针对性的治疗方式,肉瘤主要的基因突变情况有KRAS、PIK3CA、EGFR等,针对KRAS突变、EGFR突变对应的靶向药物分别是MEK抑制剂、TIKi类药物。mTOR抑制剂是针对PIK3CA基因改变信号通路的靶向药物。mTOR(mammalian target of rapamycin)是雷帕霉素的哺乳动物靶标,其具有两种复杂形式。也称作为mTORC1及mTORC2,mTOR信号通路的机制是参与肿瘤的发生过程,抑制肿瘤细胞的凋亡进程。同时增强细胞恶性程度,引起了肿瘤的生长、增殖,此外,mTOR为一种内源性存在的自噬过程中的抑制剂。肿瘤组织中也会有细胞凋亡发生,这一过程通过介导自噬进行。目前已研究出多种形式的mTOR抑制剂,其靶标涉及mTOR信号的各传导途径。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是通过与细胞内受体结合对mTORC1起作用,而对mTORC2无明显作用。雷帕霉素可以抑制IL1、IL2等生长因子及集落刺激因子的活化,抑制由于PI3K及Akt的过度激活导致的癌基因的活化,同时它还可以通过减少供应细胞的物质来源产生影响,可以限制周围血管的产生,切断游离通道并限制肿瘤细胞扩散。在黑色素瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、白血病等肿瘤细胞的研究中均显示出了抑瘤效果。雷帕霉素阻断分裂周期进展,无法完成拷贝过程,并且已证明其促进凋亡进程。目的:目前有关雷帕霉素在肉瘤中的相关研究非常少,其功能及作用机制也尚未完全明确,因此对雷帕霉素在肉瘤中的抑制功能及作用机制进行研究具有重要的意义。本实验把靶向信号通路与自噬、肿瘤干细胞相关联,深入探讨雷帕霉素作用后对肉瘤生长的影响机制,为肉瘤治疗的药物适应性提供实验基础。方法:在该研究中,将S180肉瘤细胞进行细胞培养,通过流式细胞仪、CCK8试验检测不同浓度雷帕霉素对S180细胞凋亡的影响。Transwell实验检测雷帕霉素对S180细胞侵袭、迁移能力的影响。在动物实验中,使用小鼠S180肉瘤作为研究对象,以建立小鼠S180肉瘤细胞的荷瘤模型。后对小鼠进行不同浓度雷帕霉素药物处理,实验结束后,处死小鼠并分离肿瘤组织。利用HE染色后显微镜观察小鼠S180肉瘤组织病理学变化,并利用免疫组织化学通过激光共聚焦显微技术检测S180肉瘤组织中mTOR、Beclin1、LC3、ULK1、CD133、CD90、Notch1蛋白的表达与定位。利用Real-time PCR和Western blot分别检测体外培养细胞和肿瘤组织细胞中自噬相关蛋白mTOR、Beclin1、LC3(microtuble-associated protein light chain 3)、ULK1 和肿瘤干细胞标记物CD133、CD90、Notch1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)的表达变化,从动物水平和细胞分子水平上探索研究雷帕霉素对S180肉瘤的作用机理。结果:1.雷帕霉素以剂量依赖的方式诱导S180肉瘤细胞凋亡流式结果显示不同浓度的雷帕霉素作用24h后,S180细胞凋亡增加,且随着雷帕霉素浓度的增加发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞均显著增多。表明雷帕霉素以剂量依赖的方式诱导S180细胞发生凋亡。2.雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞的迁移及侵袭。雷帕霉素作用后,S180细胞的迁移能力明显降低,且高浓度雷帕霉素作用组与对照组相比具有显著性差异。Transwell检测S180细胞侵袭结果显示雷帕霉素作用后,S180细胞的侵袭能力下降,且高浓度雷帕霉素作用组与对照组相比具有显著性差异。以上结果均提示雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制了 S180细胞的迁移、侵袭能力。3.雷帕霉素抑制荷瘤小鼠S180肉瘤生长。雷帕霉素处理后小鼠皮下肿瘤的平均体积相对于对照组降低。雷帕霉素(2 mg/kg)可抑制肿瘤生长,但与未用药小鼠相比无显著性差异。雷帕霉素(4mg/kg)治疗组中,肿瘤生长被明显抑制。第14天,未用药组的平均肉瘤体积达到2298 mm3,而雷帕霉素4mg/kg处理后平均肉瘤体积1264 mm3。2 mg/kg和4 mg/kg雷帕霉素治疗组肿瘤生长抑制率分别为30.1%和48.8%。上述结果提示雷帕霉素对小鼠S180肉瘤生长的影响与药物用量相关。4.雷帕霉素可以促进小鼠S180肉瘤组织中细胞凋亡,且凋亡程度受药物用量的影响。荷瘤小鼠S180肉瘤组织经过HE染色后,未用药物作用组肉瘤组织的细胞呈现不规则生长,排列顺序呈现为片状及嵌套状。特别是,内核的形状,颜色和大小不同,核膜厚度不均匀。雷帕霉素作用后,小鼠S180肉瘤组织出现坏死及空泡,核固缩,并随着雷帕霉素作用浓度的增大,细胞坏死及空泡,核固缩的比例明显增多。5.雷帕霉素抑制mTOR表达,并促进S180肉瘤细胞中基因Beclin1、ULK1、LC3的表达。雷帕霉素作用于S180肉瘤细胞后,mTOR的表达降低,且4 mg/kg雷帕霉素组mTOR表达与对照组有显著性差异(p0.05),提示雷帕霉素抑制S180肉瘤组织中mTOR转录、表达,抑制程度受药物剂量的影响。免疫组化及免疫荧光检测显示,在S180肉瘤细胞中,Beclin1与LC3在细胞质与细胞膜上均有表达,ULK1和mTOR主要在细胞质中表达。在培养细胞及肿瘤组织中,Real-time PCR及Western blot检测显示,与对照组相比,雷帕霉素作用后,ULK1、Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表达增加,且在4 mg/kg雷帕霉素组中ULK1、Beclin1表达与对照组相比具有显著性差异(p0.05),提示雷帕霉素能够促进ULK1、Beclin1的转录与表达。且LC3 Ⅱ/I蛋白的表达在高剂量及低剂量雷帕霉素作用组中均发生显著上调(p0.05)。6.雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞中CD90、CD133及Notch1蛋白的表达。免疫组化及免疫荧光检测显示,在S180肉瘤细胞中Notch1、CD133、CD90在细胞质与细胞膜上均有表达。在培养细胞及肿瘤组织中,应用Real-time PCR及Western blot检测显示,与未用药物组比较,经过不同浓度雷帕霉素作用后,S180肉瘤细胞中Notch1、CD133、CD90的mRNA及蛋白表达均发生下调,且在4mg/kg雷帕霉素组中其表达与无药物处理组有显著性差异(p0.05)。提示雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制S180肉瘤组织中CD90、CD133及Notch1的转录与表达。结论:雷帕霉素能够以剂量依赖的方式抑制小鼠S180肉瘤细胞的生长,杀死肿瘤,并诱导S180肉瘤细胞凋亡。雷帕霉素抑制S180肉瘤细胞的迁移及侵袭。雷帕霉素能可促进S180肉瘤细胞中Beclin1、ULK1、LC3转录、表达,并以剂量依赖的方式抑制mTOR、CD90、CD133及Notch1的转录与表达,表明雷帕霉素对小鼠S180肉瘤生长的抑制及凋亡的诱导可能与其促进自噬、抑制肿瘤干细胞标记物的表达相关。第二部分LACTB调控EMT抑制肺腺癌转移及侵袭的机制研究研究意义:肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,肺腺癌发病率约占原发性肺癌的25%,发病年龄较小,与肺鳞癌相比,恶性程度较大,容易出现远处转移。肺腺癌患者在治疗中对现行放疗和化疗不够敏感,预后较差,患者的5年总生存率很低,小于15%。因此,深入研究肺腺癌侵袭、转移机制,寻找肿瘤发展过程中的关键分子,将对今后进一步发现新的治疗靶点,实现肺腺癌的精准治疗具有重要意义。研究目的及方法:最近研究表明一种线粒体蛋白内酰胺酶β(LACTB)被报道具有抑癌功能,但在肺癌中其功能及作用机制尚未有相关报道。肺癌的上皮间质转化(EMT)与转移及复发密切相关,本研究的目的就在于探讨LACTB在肺腺癌中调控EMT、转移及侵袭的功能及作用机制。我们通过TCGA数据分析LACTB的mRNA在肺腺癌组织中的表达及启动子甲基化水平,分析LACTB表达与患者生存期的相关性。并对肺腺癌细胞中LACTB的表达进行检测,随后于肺腺癌细胞系中通过慢病毒过表达或干扰LACTB,利用MTT、划痕实验、Transwell等检测对细胞增殖、迁移的影响;检测对细胞EMT的影响,检测MMP2与EMT标志物等蛋白的表达及相关信号分子的变化,从而探讨LACTB对肺腺癌EMT及转移侵袭的调控机制。实验结果:1.LACTB的mRNA在肺腺癌中低表达,启动子甲基化水平增加,且LACTB表达与患者生存期正相关,LACTB低表达患者生存期显著少于高表达患者。2.LACTB过表达下调Snail抑制肺腺癌发生EMT,E-cadherin表达上调,N-cadherin与Vimentin表达下调;干扰LACTB表达后Snail表达上调促进肺腺癌EMT。3.LACTB过表达下调MMP2表达进而抑制肺腺癌细胞转移与侵袭;干扰LACTB表达后,MMP2表达上调,促进肺腺癌细胞转移与侵袭。实验结论:1.LACTB在肺腺癌中低表达且与患者生存期正相关;2.LACTB通过下调Snail抑制EMT,进而抑制肺腺癌转移与侵袭。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R738.1
【部分图文】：

?１?１０?２５??（ｎｍｏｉ／Ｌ）??〇?ｃｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ??＿＿＿議??Ｃ?ｃｅｌｌ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?Ｄ?ｃｅｌｌ?ｉｎｖａｓｉｏｎ??荽?８〇?「?８０?「??｜?６０?■?［－１，?１?６０?■??１?４０?－?．１?４０?？?＿?－ｃ－?＊??１２〇．?ｎ?ａ?＊?１２〇．?－?Ｉ?ｎ?ａ??Ｑ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?．?ｌ?．?Ｉ?Ｉ?．?Ｉ?＾?Ｉ?．?￣?〇????＿，?｜?？门■??０?１?１０?２５?０?１?１０?２５??图２：雷帕霉素抑制Ｓ１８０细胞的迁移及侵袭。Ａ：?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测雷帕霉素作用后Ｓ１８０细胞的??迁移＾?Ｂ：?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测雷帕霉素作用后Ｓ１８０细胞的侵袭。Ｃ，Ｄ：?Ｔｒａｎｓｗｅｌ丨检测雷帕霉素作??用后Ｓ１８０细胞迁移及侵袭的统计。＊ｐ?＜?０．０５为显著性差异，＊＊ｐ?＜?０．０１为极显著差异。??Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测雷帕霉素作用后，Ｓ１８０细胞的迁移能力显著低于对照组，表明??雷帕霉素作用使Ｓ１８０细胞的迁移能力下降。Ｓ１８０细胞的迁移能力明显降低，且高??浓度雷帕霉素作用组与对照组相比具有显著性差异。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测Ｓ１８０细胞侵袭??结果显示雷帕霉素作用后，Ｓ１８０细胞的侵袭能力下降，且高浓度雷帕霉素作用组与??对照组相比具有显著性差异。以上结果均提示雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制了??Ｓ１８０细胞的克隆形成能力及迁移、侵袭能力。??３６??

旦??｜?１５００?＊?＊??！?－??Ｉ?５００＇??０??０?２?４?６?８?１０?１２?１４??Ｄａｙｓ?ｏｆ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ??Ｂ???Ｂｏｄｙ?ｗｅｉｇｈｔ?（ｇ）??Ｄａｙ?１?Ｄａｙ?１４??Ｖｅｈｉｃｌｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?２４．８±２．３?２７．７土４．６??Ｒａｐａｍｙｃｉｎ?２?ｍｇ／ｋｇ?２６．８±２．５?２８．２±２．９??Ｒａｐａｍｙｃｉｎ?４?ｍｇ／ｋｇ?２６．８±２．４?２７．６土５．６??ｍｍｍ??图３．雷帕霉素抑制荷瘤小鼠Ｓ－１８０肉瘤的生长并诱导细胞凋亡。（Ａ）不同浓度的雷帕榑??素作用于Ｓ１８０荷瘤小鼠后，各组小鼠肿瘤体积增长曲线（ｎ＝７）。（Ｂ）?＋同浓度的雷帕霉素作??用后对Ｓ１８０荷瘤小鼠体重的影响。（Ｃ）?ＨＥ染色观察雷帕霉素治疗１４天后小鼠肉瘤组织的形??态变化（ｓｃａｌｅ?ｂａｒ＝２５?ｐｍ）。（在图Ａ和Ｂ中，数值以平均数±标准差表示。＊代表显著性差异，??ｐ＜０．０５）??为了评价雷帕霉素在小鼠体内对Ｓ１８０肉瘤的功能，我们利用了不同浓度的雷??帕霉素作用于荷瘤小鼠，观察对Ｓ１８０肉瘤生长的影响。结果显示，雷帕霉素处理??后小鼠皮下肿瘤平均体积相比于对照组低（图３Ａ）。低剂量雷帕霉素（２?ｍｇ／ｋｇ）??处理后可抑制肿瘤生长，作用后观察第１４天，抑瘤率为３０．１％，与对照组比较无显??３７??

?—麗．画?ｉ?ＵＵＫ１?????１?〇．＿?｜＿ｉ?Ｉ」隱」Ｕ：?——??ｇｊ－?■■■＊?Ｖ？ｔ？ｌｃｔ？?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｊ?１??＾?＾?Ｒａｐａｍｙｃｉｎ?２ｍｇｆｌｔｇ??＊５５?Ｒａｐａｍｙｃｉｎ?４ｍｇ／ｋｇ??％?＇……??ｒｉ?ｊ?ｑ?，??Ｉ１?ｋ?ｆ：；?Ｉ；?｜ｉ??０?ｍｌ?ＩＳｊ．?ｉ：｜．ｌ?ｉｍ??ｙ，Ｖ、、＃??ｃ?、／?，／?／?／?／??■ｉ＇＇…??。邐■■背：：：：：：：：??一?■■■?＿??．■■ｈ??图４雷帕霉素促进小鼠Ｓ１８０肉瘤的自噬。（Ａ）?Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?ＰＣＲ检测小鼠Ｓ１８０肉瘤组织中??ｍＴＯＲ、Ｂｅｃｌｉｎｌ、ＵＬＫ１?和?ＬＣ３?的?ｍＲＮＡ?表达。（Ｂ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?检测小鼠?Ｓ１８０?肉瘤组织中??ｍＴＯＲ、Ｂｅｃｌｉｎｌ、ＵＬＫ１和ＬＣ３蛋白的表达及定量。（Ｃ）免疫荧光染色显示Ｓ１８０肉瘤组织中??Ｂｅｃｌｉｎｌ、ＵＬＫ１、ＬＣ３Ａ的表达水平及定位。（Ｄ）免疫组化显示Ｓ１８０肉瘤组织中Ｂｅｃｌｉｎｌ，ＵＬＫｌ，??ＬＣ３Ａ的表达水平及定位。（＊代表显著性差异，ｐ＜０．０５）。??４０??
【参考文献】

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