背景:长段周围神经缺损修复仍是现阶段临床棘手问题,周围神经再生障碍通常会导致长期的部分或全部感觉和/或运动障碍。目前周围神经长距离缺损修复的金标准是自体神经移植,但这受供体神经来源的制约。神经导管(neural guidance conduit,NGC)可连接神经缺损的近端和远端,为轴突再生提供了物理和/或生化线索而成为目前有希望成为替代自体移植的治疗方案,导电性聚合物(conducting polymers,CPs)基功能化NGC通过维持电信号通路来增强神经再生,但是目前导电性聚合物受到其溶解性差、加工困难等缺点的限制,而难以广泛应用,因此亟需开发新型外周神经修复导电性材料以促进神经再生。目的:本系列研究主要围绕用于制备NGC的新型导电性材料展开相关探索。第一个实验体系中选用碳纳米管(carbon nanotubes,CNTs)掺杂的聚己内酯(poly(ε-caprolactone),PCL)通过静电纺丝技术制作取向度可调的中空NGC,在充分表征PCL、PCL/CNTs的理化性能及对神经细胞的行为影响后对其体内促神经再生作用进行验证。第二个实验体系在此空心导管的基础上进一步开发可溶性CP聚(3-噻吩乙酸)(poly(3-thiopheneacetic acid),PTAA)及单宁酸(tannic acid,Ta)掺杂的聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA/PTAA/Ta,PPT)电纺纤维膜,并制作取向PPT(aligned-PLGA/PTAA/Ta,A-PPT)电纺纤维NGC。管腔填充物为搭载雪旺细胞(Schwann cells,SCs)的甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸-羧基化苯胺四聚体(mPEG-PLAla-CTA)温敏性电活性水凝胶。充分表征支架及温敏性电活性水凝胶的理化性质,体内、体外验证该组织工程神经移植物(tissue-engineered nerve graft,TENG)协同电刺激(electrical stimulation,ES)促进神经修复效果,对其促神经再生机制进行探讨。材料与方法:首先通过调整滚轮转速制作取向度可调的PCL及PCL/CNTs静电纺丝纤维膜,并对其行扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、水接触角、机械性能、热行为、小角X射线散射(Small-angle X-ray scattering,SAXS)、电导率等表征。体外对肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PC12)细胞的神经行为影响的基础上,选择最优取向度的PCL/CNTs-1000 NGC用于大鼠坐骨神经10mm缺损模型,术后3个月对其进行运动功能评价、组织学评价、神经电生理及腓肠肌肌肉萎缩情况等评价其神经再生情况。TENG实验中,首先通过3-噻吩乙酸单体经无水三氯化铁化学氧化合成聚(3-噻吩乙酸甲酯)(poly(3-thiophene methyl acetate),PTMA),之后碱化水解得到PTAA,通过类似实验一的方法制备A-PPT;通过氨基化的甲氧基聚乙二醇引发L-丙氨酸N-内羧酸酐开环聚合,得到甲氧基聚乙二醇-聚丙氨酸(mPEG-PLAla)二嵌段共聚物,mPEG-PLAla与羧基化苯胺四聚体(carboxyl-capped tetraaniline,CTA)发生氨基与羧基的缩合反应制备mPEG-PLAla-CTA水凝胶,对mPEG-PLAla-CTA水凝胶质子核磁共振、傅里叶变换红外光谱、相图、流变学、循环伏安(cyclic voltammetry,CV)曲线、体内体外降解等进行充分表征,体外实验进行SCs的细胞毒性、粘附和增殖实验。该TENG协同ES修复大鼠坐骨神经10 mm缺损实验中,通过术后3个月对其进行运动功能评价、组织学评价、神经电生理及腓肠肌肌肉萎缩情况等评价其神经再生情况,并对再生神经组织中neurofilament-200(NF200)、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein,GFAP)、β3-Tubulin(TUJ-1)蛋白表达通过免疫荧光进行半定量结果分析其促神经再生机制。结果:本研究成功制备了取向度可调的具备适宜的孔隙率、机械性能良好的导电性PCL/CNTs-1000 NGC,体外实验证实其具备引导PC12细胞定向粘附、增殖能力,体内实验中术后3个月运动功能评价结果:PCL/CNTs-1000,PCL/CNTs-0+ES和PCL/CNTs-0组的坐骨神经功能指数(sciatic functional index,)评分分别为-56.89±10.12,-54.69±5.42和-69.48±5.49,显著低于自体移植组(-29.7±8.64)和PCL/CNTs-1000+ES组评分(-31.00±4.98);自体移植和PCL/CNTs-1000+ES组的轴突髓鞘较厚,分别为0.87±0.32和0.68±0.24μm,PCL/CNTs-1000+ES组的复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)潜伏期为1.33±0.06 ms与自体移植组(1.27±0.08 ms)相当,比PCL/CNTs-0组的(2.01±0.10ms)短。健康雄性大鼠、自体移植组及PCL/CNTs-1000+ES的CMAP振幅分别为12.87±0.55 mV、6.82±0.92 mV、6.74±0.28 mV。PCL/CNTs-1000+ES支架组与自体移植组相当,PCL/CNTs-1000+ES组的CMAP峰值(6.42±0.47 mV)远高于PCL/CNTs-1000组的4.27±0.28 mV和PCL/CNTs-0组的3.48±0.77 mV);腓肠肌肌肉萎缩评价结果显示PCL/CNTs-1000+ES组与自体移植组无统计学差异,横截面肌纤维面积占比与自体移植组也无差异;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白进行荧光强度半定量分析结果显示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表达水平明显高于其他组,且与自体移植组无差异。第二个实验中,制备的A-PPT电纺纤维膜取向度良好,且具有较好的亲水性,A-PPT电纺丝膜沿取向方向的电导率分别为(0.21±0.06)×10~(-3) S/m,垂直于取向方向的电导率为(0.08±0.02)×10~(-4) S/m;随机方向PLGA/PTAA/Ta(R-PPT)电纺丝膜电导率为(0.32±0.09)×10~(-4) S/m;制备的管腔填充物mPEG-PLAla-CTA水凝胶成胶性能良好,流变测试显示其储能模量高于100 Pa,CV曲线显示其具备稳定电活性;体外降解实验中分别于PBS,弹性蛋白酶,糜蛋白酶环境下30天后mPEG-PLAla-CTA降解为原重量的51.7±2.1%,35.0±2.6%,19.3±3.8%,体内降解实验4周时间内无明显炎症反应出现;体外细胞实验表明该电活性水凝胶及A-PPT电纺膜同时显示协同ES对SCs无明显细胞毒性,可促进SCs粘附与增殖。动物实验中运动功能评价中Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组的SFI评分分别为-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三组结果无统计学差异,说明术后3个月时A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组与Autograft组运动功能恢复效果相当;再生神经透射电镜结果分析2500μm~2区域大小内再生神经轴突数量Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,平均值分别为101.2,96.0个,二者无统计学差异;Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组有髓轴突直径统计结果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者无统计学差异;髓鞘厚度的统计结果Autograft组为1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES组为0.8±0.1μm,无统计学差异。神经电生理结果显示Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组CAMP振幅分别为:6.89±0.15 mV,6.79±0.10 mV,二者无统计学差异;Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组CAMP潜伏期分别为:1.26±0.09 ms,1.27±0.05 ms,二者无统计学差异;腓肠肌肌肉评价结果:Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组右侧腓肠肌与健侧腓肠肌重量比值结果分别为60.5±2.9%与64.2±2.6%,二者相比较结果无统计学差异;Masson染色图像中横截面胶原与肌纤维比值,Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组占比最小,平均值分别为9.3%与11.3%,二者无统计学差异;NF200,MBP,GFAP和TuJ-1染色蛋白进行荧光强度半定量分析结果显示蛋白在PCL/CNTs-1000+ES支架中的表达水平明显高于其他组,且与自体移植组无差异。结论:本研究开发的PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭载SCs的mPEG-PLAla-CTA温敏性导电水凝胶的TENG协同外源性ES,在大鼠坐骨神经缺损实验中SFI评分、CAMP振幅及潜伏期、轴突及髓鞘厚度、腓肠肌肌肉萎缩等结果与自体移植相当,均可促进神经特异性蛋白NF200、MBP、GFAP和TuJ-1表达,说明该系列导电性NGC/TENG协同电刺激可有效针对外周缺损病理特点,取向导管通过物理引导作用实现轴突再生及髓鞘化,mPEG-PLAla-CTA温敏性导电水凝胶其降解速率与神经再生相匹配,可在伤后早期为NGC提供物理支撑,降解后遗留的间隙为再生神经提供空间。协同外源性ES进一步提高了该系列NGC/TENG的神经修复效果,实现了周围神经缺损后的运功功能、组织学、电生理方面的神经精准修复。PCL/CNTs-1000 NGC及A-PPT NGC填充搭载SCs的mPEG-PLAla-CTA温敏性导电水凝胶的TENG的研发可有望提高极限修复长度,并最终取代自体神经移植。本系列研究的成功实施将提供一类可修复极限长度外周神经缺损的多功能组织工程神经移植物,将产生积极的经济效益和社会效益。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R318.08
【部分图文】：
术后3个月对大鼠进行运动功能评价,正常大鼠及Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组,A-PPT-Gel组,A-PPT组,R-PPT组,PLGA组的足印照片见图3.16,自体神经移植组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组与正常大鼠足迹照片类似,1–5足趾及2–4足趾距离较宽,足跟至第三足趾距离较短,进一步的SFI定量分析图表见图3.17。单纯PLGA组结果效果最差,SFI评分为-80.94±5.31,其结果与另外6组均有统计学差异;A-PPT-Gel组,A-PPT组,R-PPT组平均值分别为-51.98,-55.51,-67.23。A-PPT组结果优于R-PPT组,证明取向神经导管对运动功能恢复的重要作用;A-PPT-Gel组与A-PPT组效果无差异,且效果均较差,证明NGC管腔内填充凝胶后尚需添加SCs,电刺激等因素进一步增强恢复运动功能能力;Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组的运动SFI评分分别为-36.30±3.67,-38.12±4.18,-42.86±1.62,三组结果无统计学差异,说明术后3个月时A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组与Autograft组运动功能恢复效果相当,如进一步延长实验时间,A-PPT-Gel-SCs-ES组有望进一步恢复运动功能,甚至取得比Autograft组更好的运动功能效果。图3.17术后3个月SFI评分结果(n=3;*与自体移植组比较p<0.05;#与A-PPT-Gel-SCs-ES组比较p<0.05;Δ与A-PPT-Gel-SCs组比较p<0.05;φ与A-PPT-Gel组比较p<0.05;ψ与A-PPT组比较p<0.05;ξ与R-PPT组比较p<0.05)。
图3.16正常大鼠及Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组,A-PPT-Gel组,A-PPT组,R-PPT组,PLGA组的足印照片。3.4.3.2 再生坐骨神经组织学评价
术后3个月将电生理评价后大鼠行心脏灌注大鼠取神经标本,行H&E染色大鼠心脏灌注液为4%多聚甲醛PBS溶液;行甲苯胺蓝染色、TEM制样的大鼠心脏灌注液为2.5%戊二醛固定液。术中见各组再生神经均完整连接神经近端及远端断端,Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,A-PPT-Gel-SCs组再生神经瘢痕组织较少;A-PPT-Gel组,A-PPT组,R-PPT组,PLGA组瘢痕组织相对较多。再生神经的中段组织HE染色及TEM照片见图3.18,由H&E染色结果可见,Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组组织量较多,可先新生血管生成,A-PPT组,R-PPT组,PLGA组组织量明显减少;图3.19 ABC分别为轴突数量、有髓轴突直径、髓鞘厚度的统计结果。统计2500μm2区域大小内再生神经轴突数量Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组,平均值分别为101.2,96.0个。二者无统计学差异,说明ES对促进轴突再生有促进作用,A-PPT-Gel-SCs组,A-PPT-Gel组,A-PPT组,R-PPT组,PLGA组结果分别为80.9±3.1,58.33±3.3,49.8±2.9,30.7±2.6,31±1.3个,各组统计差异结果见图3.19 A,可见取向电纺丝、mPEG-PLAla-CTA电活性水凝胶、SCs均可作为独立因素促进轴突数量增加,但仅A-PPT-Gel-SCs-ES组与Autograft组无差异;Autograft组,A-PPT-Gel-SCs-ES组有髓轴突直径统计结果4.8±0.5μm,4.2±0.4μm,二者无统计学差异,需要指出的A-PPT-Gel-SCs组,A-PPT-Gel组,A-PPT组是A-PPT-Gel-SCs-ES组均无统计学差异;髓鞘厚度的统计结果Autograft组为1.1±0.2μm,A-PPT-Gel-SCs-ES组为0.8±0.1μm,无统计学差异。通过以上分析可知PTAA神经导管结合填充搭载SCs的电活性水凝胶组织工程移植物可以有效促进轴突数量增加,增加有髓轴突直径和髓鞘厚度。图3.19术后3个月轴突数量、有髓轴突直径、髓鞘厚度(n=3;*与自体移植组比较p<0.05;#与A-PPT-Gel-SCs-ES组比较p<0.05;Δ与A-PPT-Gel-SCs组比较p<0.05;φ与A-PPT-Gel组比较p<0.05;ψ与A-PPT组比较p<0.05)。
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2889817
