基于MicroRNA-130a靶向调节Gax探讨复方薤白胶囊对肺动脉高压血管重构的作用

发布时间：2020-11-20 13:53

　　 目的:基于MicroRNA-130a靶向调节Gax探讨复方薤白胶囊对肺动脉高压血管重构的作用。方法:1.健康雄性SD大鼠随机分为6组:对照组,模型组,阳性药物对照组,复方薤白胶囊低、中和高剂量组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水,其他组大鼠腹腔注射野百合碱(MCT)(60 mg/kg)建立肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)模型。在建模的第二天通过胃内给药,连续21天,对照组和模型组大鼠给予生理盐水,阳性药物对照组大鼠每日服用硝苯地平0.02g/kg;复方薤白胶囊低中高剂量组大鼠每天分别给予0.67g/kg、1.0g/kg、1.32g/kg。通过观察血流动力学参数和右心肥厚指数评估PAH。苏木精和伊红染色及透射电镜观察肺组织的病理特征和超微结构。免疫组织化学检测PCNA蛋白的表达。Western blot检测PCNA和细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的表达。实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA表达。2.分离培养原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)。低氧培养PASMCs,采用不同浓度的复方薤白胶囊提取液干预细胞,分别在培养6h、12h、24h检测细胞增殖情况。采用流式细胞术检测复方薤白胶囊干预后PASMCs 细胞周期,凋亡情况。Western blot 检测 PCNA、bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Gax蛋白的表达。实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA表达。3.明确复方薤白胶囊通过干预miR-130a靶向调节Gax,来调节PASMCs细胞增殖。采用RNA干扰技术,转染miR-130a模拟物(mimic)或miR-130a抑制剂(inhibitor)后,予复方薤白胶囊提取液干预,实时荧光定量检测miR-130a及Gax mRNA的表达,MTT法检测PASMCs细胞增殖情况,Western blot检测Gax蛋白的表达。进一步,采用双荧光素酶报告基因检测试验,验证Gax与miR-130a的靶向关系。采用RNA干扰技术,沉默Gax表达,予复方薤白胶囊提取液干预PASMCs,实时荧光定量检测Gax mRNA的表达,MTT法检测PASMCs增殖情况,Western blot检测PCNA、Gax蛋白的表达。结果:1.模型组的mPAP和RVSP值显着高于对照组(P0.01),表明PAH模型成功建立;复方薤白胶囊治疗后,各个治疗组的mPAP、RVSP及RVHI均显着下降(P0.01或P0.05)。HE染色结果显示,经过治疗后,肺血管壁增厚程度明显减轻,管腔增大,肺组织炎症、纤维增生等病变程度也相应减轻。透射电镜结果观察肺组织超微结构显示,经过治疗后,肺组织超微结构不同程度显示出平滑肌细胞增殖减少,内皮细胞减少,线粒体结构改善,胶原纤维减少等表现。免疫组化检测肺组织PCNA表达,模型组的PCNA阳性细胞百分比明显高于对照组(P0.01),各个治疗组均有不同程度的降低。Western blot检测肺组织蛋白表达,经过治疗后PCNA的表达水平不同程度下降,而Cytochrome C,Caspase3和Caspase9的表达则不同程度上升(P0.01或P0.05)。实时荧光定量检测大鼠肺组织miR-130a及Gax mRNA表达,模型组的大鼠肺组织miR-130a表达显著上升(P0.01),GaxmRNA的表达显著下降(P0.01);经过复方薤白胶囊药物干预后,各组miR-130a表达显著下降(P0.01或P0.05),Gax mRNA表达显著上升(P0.01)。2.大鼠原代肺动脉平滑肌细胞培养经过鉴定,可鉴定培养的细胞为肺动脉平滑肌细胞。缺氧24小时后,低氧培养的PASMCs增殖最为显著(P0.01),复方薤白胶囊提取液可抑制PASMCs的增殖,抑制效果呈现出浓度依赖。流式细胞仪分析显示,低氧组细胞G1期细胞百分比下降,S期细胞百分比上升;药物干预组的G1期细胞百分比上升,S期细胞百分比下降。流式细胞仪检测凋亡水平结果显示,与正常组相比,低氧组PASMCs调亡细胞比率显著降低(P0.01);经过复方薤白胶囊提取液干预后,低氧干预的PASMCs凋亡细胞率增加。Western blot检验PCNA、bcl-2蛋白,在低氧组的表达水平显着高于对照组,经过药物干预以后,药物干预组的PCNA及bcl-2蛋白表达水平显著下降(P0.01);caspase3、caspase-8、caspase-9、Gax在低氧组的表达降低,经过药物干预以后,表达上升(P0.05或P0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,低氧组PASMCs的miR-130a表达显著上升(P0.01),Gax mRNA表达显著下降(P0.01);经过药物干预后,miR-130a表达显著下降,Gax mRNA表达显著上升(P0.05或P0.01)。3.转染miR-130a mimic或miR-130a inhibitor后,实时荧光定量PCR结果显示,Gax mRNA的表达水平与miR-130a呈现相反趋势。转染miR-130a mimic,对于PASMCs增殖有促进作用;转染miR-130a inhibitor,对于PASMCs增殖起到抑制作用;低氧组PASMCs的增殖水平显著升高(P0.01),经过复方薤白胶囊干预PASMCs后,低氧+药物组、低氧+药物+miR-130a mimicNC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor NC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor组的增殖水平均显著降低,其中低氧+药物+miR-130a inhibitor组最低;而低氧+药物+miR-130a mimic组增殖水平则上升。Western blot检验结果显示,与对照组相比,低氧组的Gax蛋白水平显著降低(P0.01);复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+mimic NC组、低氧+药物+inhibitor NC组、低氧+药物+miR-130a inhibitor组Gax蛋白表达水平均显著升高(P0.01),并且在低氧+药物+miR-130a inhibitor组的表达水平最高;低氧+药物+miR-130amimic组表达水平显著降低(P0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果验证了 Gax是miR-130a的靶基因,表明二者有直接靶向作用关系。进一步通过siRNA-Gax转染细胞,予复方薤白胶囊干预后,与对照组比较,低氧组PASMCs的GaxmRNA表达水平显著降低(P0.01);低氧+药物组、低氧+药物+siRNA NC对照组的Gax mRNA表达水平均有所升高;低氧+药物+si-Gax组表达水平则进一步降低。MTT实验结果显示,低氧组PASMCs的增殖水平显著升高(P0.01);经过复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+si-NC组的增殖水平显著降低;低氧+药物+si-Gax组增殖水平显著上升。Western blot结果显示,低氧组Gax蛋白表达水平显著降低(P0.01),PCNA蛋白水平明显升高(P0.01);复方薤白胶囊干预后,低氧+药物组、低氧+药物+si-NC组Gax表达水平显著升高,PCNA表达水平显著降低(P0.05或P0.01);而低氧+药物+si-Gax组的Gax的表达水平明显下降(P0.01),PCNA表达水平显著升高(P0.05)。结论:1.复方薤白胶囊对于PAH大鼠治疗有效,可以改善其临床症状;降低肺动脉压、右心室压,改善右心肥厚;改善肺血管重构,改善肺组织有关血管的超微结构;抑制PCNA的表达,促进细胞色素C、Caspase-3、Caspase-9的表达;降低肺组织miR-130a的表达,升高Gax mRNA的表达。2.成功分离培养大鼠原代肺动脉平滑肌细胞,复方薤白胶囊对于低氧培养的PASMCs细胞具有改善增殖、改善细胞周期、促进凋亡的作用;可以降低PCNA、bcl-2蛋白水平,提高caspase-3、caspase-8、caspase-9、Gax表达水平;可以降低miR-130a表达水平,升高Gax mRNA表达水平。3.细胞转染及双荧光素酶报告基因结果显示,Gax是miR-130a的靶基因。miR-130a可以抑制Gax mRNA的表达,miR-130a对于低氧培养的PASMCs增殖有促进作用,Gax对于低氧培养的PASMCs增殖有抑制作用。复方薤白胶囊通过干预miR-130a靶向调控Gax,发挥对于PASMCs的增殖抑制作用。4.复方薤白胶通过干预miR-130a靶向调控Gax,抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,达到改善肺血管重构、降低肺动脉高压的作用。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

??构稍欠清，伴有轻度炎性细胞浸润，及胶原纤维增生。??本实验条件下，肺组织病变主要表现为肺内血管壁增厚、管腔狭窄。多数大鼠有轻重??程度不等的炎细胞浸润。经过各组药物治疗后，肺组织病变均不同程度减轻，表现为血管??壁增厚程度明显减轻，管腔增大，肺组织炎症、纤维增生等病变程度也相应减轻。各剂量??组相比，复方薤白胶囊中高剂量组对肺血管重构干预作用较为明显。??Ｈ■圓??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＰＡＨ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??■画圃ｉ??ＣＸＣＬ?ＣＸＣＭ?ＣＸＣＨ??图２－１复方薤白胶囊对各组ＰＡＨ大鼠肺血管结构的影响（Ｈ＆Ｅ，比例尺ｌＯＯｇｍ）??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｃｏｍｐｏｕｎｄ?ｘｉｅｂａｉ?ｃａｐｓｕｌｅ?ｏｎ?ｐｕｌｍｏｎａｒｙ?ｖａｓｃｕｌａｒ?ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ?ｉｎ?ＰＡＨ?ｒａｔｓ??（Ｈ＆Ｅ，ｓｃａｌｅ?ｂａｒ?＝?１００?ｊｉｍ）??２．３．４透射电镜观察肺组织的超微结构??在对照组中，内皮细胞扁平，线粒体结构，结缔组织和平滑肌细胞是正常的，有少量??的成纤维细胞及胶原纤维。在模型组中，线粒体结构异常，存在血管收缩，血管壁内的平??滑肌细胞增加，其间胶原纤维密集，内皮细胞增厚和肿胀，毛细血管腔狭窄和毛细血管周??围水肿。在阳性药物对照组中，平滑肌细胞相对减少，胶原纤维密度降低，线粒体结构异??常。低剂量组中，线粒体结构相对异常，内皮细胞还有肿胀、增厚现象，毛细血管管腔相??１８??

?南京中医药大学博士学位论文???对较狭窄，胶原纤维增多。中剂量组中，线粒体结构有所改善，毛细血管壁内平滑肌细胞??相对减少，水肿范围较校高剂量组中，线粒体结构有一定改善，毛细血管管腔相对正常，??胶原纤维相对减少，水肿范围较校??本实验条件下肺组织超微结构改变主要表现为平滑肌细胞增加，内皮细胞及线粒体异??常胶原纤维密集，水肿等表现。复方薤白胶囊千预后，以上改变不同程度得到改善。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＰＡＨ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??＿＿＿??ＣＸＣＬ?ＣＸＣＭ?ＣＸＣＨ??图２－２透射电子显微镜（比例尺＝５ｐｍ）观察大鼠肺组织的超微结构??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｒａｔ?ｌｕｎｇ?ｔｉｓｓｕｅ?ｗａｓ?ｅｘａｍｉｎｅｄ?ｕｓｉｎｇ?ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ?ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??（ｓｃａｌｅ?ｂａｒ?＝?５?＾ｍ）??２．３．５免疫组化观察肺组织增殖细胞核抗原表达??为了研究复方薤白胶囊是否减少平滑肌细胞的增殖，使用免疫组织化学检测了肺组织??细胞中增殖标志物ＰＣＮＡ的表达（图２－３）。空白组中，肺组织可找到少量ＰＣＮＡ阳性细??胞。模型组肺组织可发现大量ＰＣＮＡ阳性细胞，血管内外均有发现。??ＭＣＴ组的ＰＣＮＡ阳性细胞百分比明显高于对照组（Ｐ?＜０．０１）。经过治疗后，各个治??疗组中，ＰＣＮＡ阳性细胞百分比均有不同程度的降低＜０．０１），而中高剂量组的ＰＣＮＡ??阳性细胞百分率显示较低。结果表明，复方薤白胶囊减少了肺血管平滑肌的增殖，也说明??通过减少增殖进而改善肺血管重构。??１９??

?第二部分复方薤白胶囊对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响???＿酬＿?丨?Ｌｉｉｔ：??＾微⑤ｉＴｆＴＴｒ??ＣＸＣＬ?ＣＸＣＭ?ＣＸＣＨ??图２－３免疫组化法检测肺组织中增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）阳性细胞的表达（比例尺＝１００＾ｉｍ?）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ?ｃｅｌｌ?ｎｕｃｌｅａｒ?ａｎｔｉｇｅｎ?（ＰＣＮＡ）－ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｅｌｌｓ?ｉｎ?ｌｕｎｇ?ｔｉｓｓｕｅ，?（ｂａｒ?＝１００??＾ｍ）．与对照组相比，＊＊尸＜０．０１；与模型组比较＃＃Ｐ?＜０．０１。??２．３．６蛋白免疫印迹实验（Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ）检测相关蛋白表达??在蛋白水平，以蛋白免疫印迹实验检测复方薤白胶囊对增殖和凋亡相关蛋白质水平??的影响。??增殖细胞核抗原ＰＣＮＡ的表达，模型组ＰＣＮＡ的表达水平显着高于对照组（户＜０．０１），??而Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ?Ｃ，Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ９的表达则显着降低（尸＜０．０１?）。经过复方薤白胶??囊治疗后，治疗组中ＰＣＮＡ蛋白水平均有所下降。同时，ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ９??蛋白的水平均有不同程度升高，特别是在中剂量组和高剂量组，这显示出复方薤白胶囊的??干预效果。这些结果表明，复方薙白胶囊抑制了增殖相关蛋白ＰＣＮＡ的表达水平，并促进??了调亡相关蛋白Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ?Ｃ，Ｃａｓｐａｓｅ３和Ｃａｓｐａｓｅ９的表达。??１．５－??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＰＡＨ?ＰＣ?ＣＸＣＬ?ＣＸＣＭ?ＣＸＣＨ?－ｒ??Ｉ?１．０－?－Ｌ?Ｔ?＃?ａ?＃?ｃ?〇Ｊｔ￣?ｉ?．．?？？，??
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本文编号：2891508