研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)患者死亡的重要原因。高磷血症(Hyperphosphatemia)是CKD患者,尤其终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD)患者常见的并发症。流行病学与临床研究表明:血磷水平增高与胆固醇代谢异常及动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)风险密切相关,但具体分子机制尚未阐明。目的本课题在前期动物实验研究基础上,旨在深入揭示高磷血症对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)内胆固醇稳态的影响,进一步探索高磷血症通过改变胆固醇敏感器-固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(Sterol regulatory element binding protein cleavage activating protein,SCAP)的糖基化修饰,加速VSMCs内胆固醇异常合成与蓄积,导致AS斑块泡沫细胞形成的分子机制。方法1.选择原代人主动脉VSMCs为细胞模型,予以不同浓度磷(Pi1.0~3.0mmol/L)、钠磷协同转运体(Sodium-dependent phosphate cotransporter,NPC)阻断剂磷甲酸(Phosphonoformic acid,PFA)以及SCAP和固醇调节元件结合蛋白2(Sterol regulatory element binding protein,SREBP2)的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)干预细胞。通过中性脂质油红O染色、酶法定量胆固醇测定、Real-time PCR、Western blotting及激光共聚焦等方法,检测高磷环境(Pi3.0mmol/L)对VSMC内胆固醇水平与细胞内胆固醇代谢关键分子,如羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A reductase,HMRCR)、低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor,LDLr)、SREBP2、SCAP等mRNA和蛋白水平、功能的影响。2.通过蛋白质半衰期检测、N-糖基化诱导与抑制试验、N-糖链类型酶切鉴定以及激光共聚焦等手段,探讨高磷血症致SCAP异常转位激活SREBP2的关键分子机制。3.通过酶促化学反应比色法、Real-time PCR及Western blotting等方法,检测复杂型N-糖基化的关键酶—α-甘露糖苷酶Ⅱ(α-MannosidaseⅡ,α-MANⅡ)在SCAP介导的细胞内胆固醇合成中的功能,并利用siRNA基因沉默技术,进一步揭示α-MAN2A1与α-MAN2A2在增强SCAP N-糖链由高甘露糖型向复杂型转化中的作用。结果1.高磷环境下,VSMCs内中性脂质大量聚集,总胆固醇(Total Cholesterol,TC)及胆固醇酯(Cholesterol Ester,CE)水平明显增高。高磷环境不影响肝X受体α(Liver X receptor,LXRα)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(Adenosine triphosphate binding cassette transporter 1,ABCA1)的mRNA与蛋白水平,但显著上调SREBP2、HMGCR与LDLr的基因转录,增高SREBP2的活性氨基末端片段(The NH_2 terminal fragment of SREBP2,SREBP2-N)、HMGCR及SCAP的蛋白水平。高磷环境下,SCAP荧光染色明显增强,且与高尔基体共定位明显增加。磷呈剂量依赖性(Pi 1.0~5.0mmol/L)地上调HMGCR、SCAP蛋白水平。3.0mmol/L磷处理VSMC后4小时即检测到SCAP蛋白明显增高,16小时即检测到HMGCR水平明显增高。磷通道阻滞剂PFA可明显阻断高磷环境下上述分子的基因及蛋白表达变化,并抵消其对VSMCs内胆固醇的蓄积作用。沉默SCAP或沉默SREBP2基因表达能够显著降低VSMCs内HMGCR表达及SREBP2-N蛋白水平,同时抵消高磷环境对VSMCs内胆固醇的蓄积作用。2.生理条件下(磷1.0mmol/L),放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理8小时,SCAP蛋白水平显著下降;CHX处理后24h,SCAP蛋白水平即衰减至0h时的22%。但高磷环境下,SCAP蛋白质水平在CHX处理后24小时才出现显著下降,且维持在0h时的48.9%。N-糖基化促进剂—N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)(20mmol/L)显著提高SREBP2及HMGCR表达水平,而N-糖基化抑制剂—衣霉素(Tunicamycin,Tuni)(1μg/mL)可抵消高磷环境对上述分子表达的上调作用。生理条件下,SCAP蛋白N-糖链大部分呈对Endo.H敏感的高甘露糖型,而高磷环境下则绝大部分成为对Endo.H抵抗的复杂型糖链。SCAP N-糖链向复杂型转化后,SCAP蛋白降解显著延迟,促进活化SREBP2及其下游分子表达。GlcNAc增强VSMCs内SCAP荧光强度及其与高尔基体共定位,该作用与高磷环境相似。Tuni减弱VSMCs内SCAP荧光强度及其与高尔基体共定位,并抵消高磷环境对SCAP荧光强度及与高尔基体共定位的影响。3.高磷环境下,VSMCs内α-MANⅡ活性明显增强,该变化可被Tuni或PFA明显抵消。随着磷浓度增加,α-MANⅡ活性逐渐增强。沉默α-MAN2A1或α-MAN2A2基因,可阻断高磷环境对VSMCs内α-MANⅡ活性的增强作用,恢复SCAP蛋白降解速率,减弱SCAP蛋白与高尔基体的共定位,并减少SREBP2及HMGCR的mRNA表达。结论1.高磷环境下,人原代主动脉VSMCs内胆固醇显著蓄积,该蓄积效应由SCAP-SREBP2信号通路特异性介导。在转录后水平,SCAP蛋白质含量显著增高,增强其由内质网向高尔基体转位激活SREBP2的功能,增多的SREBP-N转位入核,上调HMGCR基因转录,增强细胞内的胆固醇合成,最终导致其异常蓄积。2.促进或抑制N-糖基化过程可调控HMGCR及SREBP2的表达。高磷环境下,SCAP蛋白质N-糖链由高甘露糖型向复杂型转化显著增加,致VSMCs内SCAP蛋白降解减慢,半衰期延长。3.高磷血症通过增加VSMCs内α-MANⅡ的活性,促进SCAP蛋白质N-糖链复杂型转化。阻断VSMCs外环境中的磷向细胞内转运,或抑制N-糖链由高甘露糖型向复杂型转化过程能够恢复VSMCs内SCAP正常降解,维持SCAP对SREBP2转位激活及细胞内胆固醇稳态的调节功能。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R692.5;R589.5
【部分图文】：
将传代至5-7代的VSMCs分为两组:正常磷组(Ctrl组)及高磷组(Pi组)。先予以2%FBS的实验培养基预处理24h,再分别予以正常磷环境(Pi 1.0mmol/L的实验培养基)或高磷环境(Pi 3.0mmol/L的实验培养基)处理24h,进行油红O染色。结果显示:Pi组VSMCs细胞内红色中性脂滴明显增多,提示高磷环境促进VSMCs细胞内中性脂质蓄积。3.2高磷环境对VSMCs内胆固醇含量的影响
细胞内胆固醇含量测定结果表明:高磷组(含Pi 3.0 mmol/L的实验培养基)VSMCs内TC含量达103.25±11.20μg/mg,而对照组(含Pi 1.0 mmol/L的实验培养基)为62.60±8.45μg/mg(P<0.01)。高磷组VSMCs内CE含量达74.12±8.51μg/mg,而对照组为36.05±40μg/mg(P<0.01)。两组间FC含量无显著变化,分别29.13±6.89μg/mg和26.56±5.68μg/mg。3.3高磷环境对VSMCs胆固醇代谢相关分子mR NA表达水平的影响
VSMCs分为对照组(Pi 1.0mmol/L)及高磷组(Pi 3.0mmol/L),采用Real-time PCR法检测高磷对VSMCs胆固醇代谢相关分子HMGCR、LDLr、SREBP2、ABCA1及LXRαmRNA表达水平的影响。图1.3所示,与对照组相比,高磷组VSMCs HMGCR mRNA表达增至1.97±0.13倍(P<0.01),LDLr mRNA表达增至1.35±0.24倍(P<0.05),SREBP2mRNA表达增至2.19±0.31倍(P<0.01),但ABCA1、LXRαmR NA水平无显著变化。3.4高磷环境对VSMCs内胆固醇代谢相关分子蛋白水平的影响
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2892115
