转录因子PBX1对自然杀伤细胞早期发育的调控及其机制研究

发布时间：2020-11-21 04:12

　　 自然杀伤(Naturalkiller,NK)细胞在机体抗肿瘤、抗病原微生物感染、妊娠和免疫调节等过程中发挥重要作用。随着免疫治疗的兴起,NK细胞也逐渐用于治疗肿瘤、自身免疫病甚至生殖相关疾病。然而,由于对NK细胞发育分化的了解有限,NK细胞体外扩增仍然困难。成年小鼠NK细胞由造血干细胞(haematopoietic stem cells,HSC)发育而来,经历共同淋巴细胞前体(common lymphoid progenitors,CLP)、pre-NK前体细胞、rNK前体细胞、未成熟NK细胞、成熟NK细胞各个阶段。从CLP向pre-NK前体细胞发育是决定NK细胞谱系形成的关键阶段。转录因子NFIL3决定了 CLP向NK细胞前体的发育,是调控NK细胞早期发育的关键因子。已有文献报道NFIL3通过调节转录因子TOX、EOMES、ID2的表达来促进NK细胞的发育。但目前还没有文献报道什么分子能直接上调NFIL3。PBX1是一个在胚胎发育过程中发挥诸多作用的转录因子。造血系统特异性缺失PBX1的小鼠HSC稳态被打破,更多地处于细胞分裂状态,自我更新能力受损,其CLP细胞、B细胞、NK细胞明显减少,但T细胞正常。T细胞与NK细胞都由CLP分化而来。因此,除了 PBX1缺陷会影响HSC自我更新之外,应当存在其他原因导致CLP向NK细胞发育受损。并且在NK细胞发育过程中PBX1的作用靶标也是未知的。因此我们关注NK细胞核心转录因子NFIL3的上游转录调控机制,研究转录因子PBX1是否可以直接调控NFIL3表达及其分子机制,获得了如下结果:1.缺失PBX1时NK细胞早期发育受损为探究PBX1在NK细胞发育过程中的作用,我们构建了造血系统特异性缺失PBX1的小鼠。通过流式细胞术检测发现,缺失PBX1的小鼠骨髓NK细胞前体(pre-NKP和rNKP)和小鼠NK细胞比例和数目均下降,而T细胞不变。因此PBX1可能作用于CLP向NK细胞前体发育的阶段。2.缺失PBX1时NK细胞表达NFIL3水平下降缺失PBX1导致NK细胞前体减少,这与缺失NFIL3的小鼠现象一致。为探究PBX1是否影响NFIL3表达水平,我们使用流式内标技术检测了 PBX1条件性敲除小鼠,发现缺失PBX1的骨髓和脾脏NK细胞内NFIL3及其下游分子EOMES的表达量明显下降。因此PBX1能影响NFIL3的表达。3.PBX1可以直接结合Nfil3启动子为探究PBX1是否通过直接结合Nfil3启动子发挥作用,我们通过生物信息学预测,发现Nfil3启动子区含有潜在的PBX1结合位点。通过小鼠骨髓NK细胞ChIP实验证明NK细胞中PBX1结合了Nfil3启动子上预测结合位点所在区域。通过萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验我们也证明了在体外PBX1能结合并活化Nf113启动子。4.NFIL3启动子区PBX1结合位点缺陷的小鼠NK细胞早期发育受损PBX1缺失会导致CLP减少,这与NFIL3缺失不一致,这一差异是由于PBX1影响造血干细胞稳态。为了排除PBX1对造血干细胞的影响,我们用CRISPR-Cas9技术敲除小鼠基因组Nfil3启动子中PBX1结合位点,流式细胞术检测发现该小鼠骨髓CLP细胞比例不变而pre-NKP和rNKP细胞比例下降,NK细胞比例下降,而T细胞、B细胞比例不变。因此当PBX1不再调控Nfil3启动子后,从CLP向NK细胞谱系形成发育受损。表明PBX1确实通过结合Nfil3启动子调控NK细胞早期发育。5.PBX1结合Nfil3启动子依赖于PBX1第286位氨基酸为了检测PBX1蛋白上哪些氨基酸介导与Nfil3启动子的结合,我们对PBX1进行分区截短以及单个氨基酸替换突变,进行萤光素酶报告实验和DNA-pulldown实验,发现PBX1第286位氨基酸天冬酰胺对与Nfil3启动子的结合起关键作用。综上所述,我们证明了转录因子PBX1可以通过其homeodoiman中第286位天冬酰胺结合Nfil3启动子促进NFIL3转录,从而促进NK细胞的早期发育。该课题完善了对PBX1的相关研究,并有助于了解NK细胞的发育。这也为NK细胞体外扩增用于细胞免疫治疗奠定了理论基础。该研究的创新之处在于:(1)我们首次报道NK细胞发育过程中NFIL3上游直接调控NFIL3表达的转录因子;(2)我们完善PBX1对NK细胞发育的影响机制,PBX1调控NFIL3表达从而影响CLP向pre-NKP细胞发育;(3)我们找到PBX1蛋白中影响其结合Nfil3启动子能力的单个氨基酸Asp286。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R392
【部分图文】：

?第一章绪?论???Ａ．?ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ－ｓｅｌｆ，??Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ??ＷＲ．?Ｓｅｌｆ－??遍＇＇??ＮＫｃｅｌｌ?Ｔａｒｇｅｔ?ｃｅｌｌ??‘Ｍｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆ’??ＫＩＲ．?Ｎｏ?ｎ??，?＾ｓ！－ｙ４９?ＭＨＣ＾?？??⑩〇心??Ｃ．?＇Ｉｎｄｕｃｅｄ－ｓｅｌｆ??Ｋ，Ｒ－?Ｓｅｌｆ－?〇??Ｈ６０??Ｄ．?＇Ｎｏｎ－ｓｅｌｆ＇??ＫＪＲ，?Ａｌｉｏ－?０??涵ＪＴ＇ｎ??Ｈ６０??图１．１?ＮＫ细胞识别靶细胞机制??图注：Ａ．抑制性受体（人ＫＩＲ或小鼠Ｌｙ４９）识别自身ＭＨＣ－丨类分子（人ＨＬＡ或小??鼠Ｈ２），?ＮＫ细胞识别自身正常细胞，抑制ＮＫ细胞活化；Ｂ．靶细胞不表达或者??低表达ＭＨＣ－Ｉ类分子，ＮＫ细胞活化；Ｃ．?ＮＩＣ细胞表面ＮＫＧ２Ｄ识别靶细胞表面??Ｍ１Ｃ－Ａ／ＢＣ小鼠为Ｈ６０），或小鼠ＮＫ细胞表面Ｌｙ４９Ｈ识别靶细胞表面ｍｌ５７，则??活化信号超过抑制信号，ＮＫ细胞被活化；Ｄ．当移植的供者组织表达异源或单倍??体ＭＨＣ－Ｉ时ＮＫ细胞识别移植细胞并被活化。（引自ＡｌｅｘＭ．Ａｂｅｌ．??ｉｎ?Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．?２０１８）?４??２??

?第一章绪?论???显减少。并且ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ在移植后所有谱系的重建能力都严重下降８，９。??ＦＬＴ３Ｌ缺陷小鼠的骨髓ＨＳＣ数量不变，ＣＬＰ数量下降，但ＦＬＴ３Ｌ缺陷的ＨＳＣ??在骨髓移植后分化能力不受影响ＩＧ。这与ＭＰＰ表达ＦＬＴ３，与基质细胞上的ＦＬＴ３Ｌ??相互作用促进分化是一致的。??／Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ?／ｔ??＼?；?＼ｉ??图１．２骨髓中ＮＫ细胞发育的微环境??图注：骨髓窦状隙样血管附近的低氧微环境中，激素和细胞因子诱导生成静息状态造??血干细胞。在ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ等因子刺激下，ＨＳＣ分化为ＣＬＰ。非骨髓基质细胞（间??充质基质细胞ＭＳＣ，成纤维网状细胞）产生【Ｌ－７或［Ｌ－１５，促进ＣＬＰ细胞分化为??不同淋巴细胞，包括ＮＫ细胞前体。ＭＳＣ也产生１Ｌ－２１帮助ＮＫ细胞前体扩增。??ＣＸＣＬ１２充足的网状细胞ＣＡＲ产生ＣＸＣＬ１２，通过细胞表面的ＣＸＣＲ４促进ＮＫ??细胞前体或未成熟ＮＫ细胞分化为成熟ＮＫ细胞。成熟ＮＫ细胞通过窦状隙样血??管迁移至次级淋巴器官。其他类型细胞，周细胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ）、巨核细胞??（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ）、脂肪细胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、冠层细胞（ｃａｎｏｐｙ?ｃｅｌｌ）、成骨细胞??（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、破骨细胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）、骨细胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）也帮助形成骨髓微环境??ｎｉｃｈｅ?和支撑体系。（引自?Ａｌｅｘ?Ｍ．?Ａｂｅｌ．，ｅｔ?ａｌ．?Ｆｒａｎｈｅｒｊ１?／？?／／ｗｍｔｆｊｏ／ｏｇｙ?２０?丨?８）?４??ｃ－Ｋｉｔ缺陷小鼠ＣＬＰ数目减少，并且ｃ－ｔｏ缺陷的ＨＳＣ骨髓重建能力也明显??下降１１。同时，

???ＨＳＣ??？?ＣＬＰ??？?ｐｒｅ－ＮＫＰ??？?ｒＮＫＰ??？?ＮＫ??ＳＣＦ?ＩＬ－１５??ＦＬＴ３Ｌ??ＣＸＣＬ１２?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－?Ｌｉｎ－??ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ２７＋?ＣＤ１２２＋??ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＣＤ２４４．２＋?ＮＫ１．１?＋??ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋?ＩＬ－７Ｒａ＋??Ｆｌｔ３＋?Ｆｌｔ３－?Ｆｌｔ３－??ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２－?ＣＤ１２２＋??图１．３成年小鼠骨髄ＮＫ细胞发育过程??１．２．４胸腺中的ＮＫ细胞发育??在胎儿和成年人或小鼠的胸腺中有少量ＮＫ细胞，这群ＮＫ细胞杀伤肿瘤细??胞活性下降，但在ＩＬ－１２刺激下胸腺ＮＫ细胞分泌细胞因子ＩＦＮ－ｙ、ＧＭ－ＣＳＦ、??ＴＮＦａ能力上升。胸腺ＮＫ细胞参与调节淋巴结中的树突状细胞功能以及胸腺肿??瘤细胞的免疫监视。与传统的骨髓依赖的ＮＫ细胞不同，胸腺ＮＫ细胞不表达??Ｌｙ４９，ＣＤｌｌｂ?和?ＣＤ４３，但表达?ＣＤＩ２７?（ｌＬ－７Ｒｃｉ），也表达?ＣＤ４９ｂ。胸腺?ＮＫ?细胞??可以出胸腺进入外周淋巴器官。??使用谱系追踪的方法发现成年小鼠胸腺中仅有小于１０％的ＮＫ细胞是表达??及ｏｒｅ的双阳性胸腺细胞的后代，并且几乎没有胸腺ＮＫ细胞表达细胞内ＣＤ３ｓ。??使用ＧＦＰ报告小鼠也发现胸腺ＮＫ细胞不表达Ｒａｇ２，表明ＮＫ细胞不重排ＴＣＲＹ，??说明胸腺ＮＫ细胞不来源于双阴性胸腺细胞前体。转录因子ＭＶｃ／ｚ在淋巴细胞前??体向Ｔ细胞谱系形成中发挥重要作用，如果胸腺ＮＫ细胞来源于早期胸腺祖细??胞（ＥＴＰ），则其发育应依赖于Ｎｏｔｃｈ信号
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 邓丽莲;;延续性早期发育支持护理对改善早产儿智能发育水平的影响分析[J];中国实用医药;2017年17期

2 黄颖;;早期发育支持护理对早产儿生长发育的影响[J];中国卫生标准管理;2015年08期

3 曲华;魏益民;;正确的儿童保健对婴幼儿早期发育的影响分析[J];中国继续医学教育;2015年27期

4 Einspieler C.;Kerr A.M.;Prechtl H.F.R.;宁亮;;Rett病的女性患儿早期发育是否正常[J];世界核心医学期刊文摘(儿科学分册);2005年10期

5 李玲;苏淑钗;寇艳茹;;板栗座果及果实早期发育与内源激素质量分数的关系[J];东北林业大学学报;2020年05期

6 李兴美;何勇;李兴芳;李志惠;程德元;侯晓琪;;长顺绿壳蛋鸡早期发育在酶作用下性逆转研究[J];中国饲料;2020年12期

7 ;良好的生命开端是可持续未来的保证[J];中国妇幼健康研究;2016年12期

8 李颖;冯云;;促性腺激素释放激素及其受体在人类胚胎着床与早期发育中的作用[J];生殖医学杂志;2016年08期

9 ;儿童早期发育科学国际研讨会在上海召开[J];临床精神医学杂志;2003年01期

10 常韶华,杨怀文;用昆虫病原线虫液相培养早期发育指标预测产量的研究[J];中国生物防治;1997年03期

相关博士学位论文 前10条

1 徐秀秀;转录因子PBX1对自然杀伤细胞早期发育的调控及其机制研究[D];中国科学技术大学;2020年

2 熊亚明;福寿螺早期发育免疫保护机制的初步研究[D];华南农业大学;2018年

3 高小强;美洲鲥Alosa sapidissima早期发育组织学及相关生理特性研究[D];中国海洋大学;2015年

4 柴毅;中华鲟感觉器官的早期发育及其行为机能研究[D];华中农业大学;2006年

5 何滔;条石鲷早期发育及相关酶活性的研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2011年

6 赵凤娟;马尾藻种群遗传及早期发育的研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2007年

7 徐朋朋;ETS转录因子调控importin4基因表达的研究[D];厦门大学;2014年

8 韩晓帅;基因组范围RNAi筛选涡虫再生与稳态必需转录因子[D];上海交通大学;2016年

9 侯佳音;番茄TGA2转录因子在农药百菌清代谢降解中的功能及调控机制[D];浙江大学;2019年

10 Mudassar Ahmad;梨CBF和NAC转录因子系统进化及基因结构和功能研究[D];浙江大学;2019年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘燕;转录因子PBX1在前列腺癌耐药中的作用及机制研究[D];苏州大学;2018年

2 罗俊;鸭法氏囊早期发育过程中的组织学观察与转录组学分析[D];四川农业大学;2018年

3 朱秀生;LPA对猪孤雌胚胎早期发育及多能性标志基因的影响[D];广西大学;2017年

4 林鹏;TRIM26介导转录因子PBX1降解而促进非小细胞肺癌细胞增殖的机制研究[D];苏州大学;2019年

5 陈星;谷精草属植物个体早期发育及种间亲缘关系的研究[D];北京林业大学;2008年

6 王帅;孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）繁殖细胞的获得及早期发育的观察[D];中国海洋大学;2013年

7 张宁宁;同源盒基因HOA10和PBX1在口腔鳞癌中的表达及其临床意义[D];华中科技大学;2012年

8 杨蕾;短发夹RNA靶向沉默PBX1基因抑制非小细胞肺癌细胞增殖的实验研究[D];昆明医科大学;2012年

9 蒋艳辉;Notch3调控Pbx1促进非小细胞肺癌增殖的研究[D];昆明医科大学;2016年

10 付亚茹;玉米气生根早期发育的转录组和候选基因的功能分析[D];山东农业大学;2011年

本文编号：2892503