组织蛋白酶S活性调控小鼠缺血诱导的血管再生机制及冠心病患者血清中组织蛋白酶K的变化

发布时间：2020-11-21 05:33

　　 目的：组织蛋白酶S (CatS)通过修饰／分解各种生物活性物质调控内皮细胞(ECs)的生物活性。目前为止,组织蛋白酶中,组织蛋白酶L和K在病理性血管再生中的作用有报道,但是CatS在血管形成,尤其在缺血性血管生成中表达及其作用尚无报道。研究CatS基因敲除是否影响缺血性血管再生及探明它的机制。本研究为寻找下肢缺血性疾病新治疗靶点提供理论基础。材料与方法；本研究利用制备下肢缺血模型,观察缺血缺氧对CatS的蛋白表达及其活性变化,明确其在缺血性血管再生的作用。应用CatS基因敲除小鼠进一步证实通过血管再生相关的信号通路调控内皮细胞(ECs)和内皮祖细胞(EPCs)的功能。在动物和细胞实验,采用基因沉默／转染、免疫组织化学染色/免疫荧光染色、流式细胞仪检测(FACS)、骨髓移植、免疫蛋白印迹(Western Blot)、主动脉环试验(Aortic Ring Asssay)等多种检测方法揭示CatS在缺血性血管再生中的作用。结果：1.CatS基因敲除明显抑制缺血性血管再生反应。用激光多普勒超声血流仪检测下肢血流的动态变化。观察到术后即刻、术后1天血流明显下降,术后第4天开始血流逐渐恢复,CatS基因敲除小鼠缺血下肢血流恢复明显慢于正常对照组。用CD31免疫染色重点分析了毛细血管的形成。观察到CatS基因敲除小鼠与正常对照组比较在缺血骨骼肌毛细血管形成明显受阻,CatS基因敲除小鼠的毛细血管密度明显低于正常对照组。2.组织蛋白酶S基因敲除明显降低过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPAR-y)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-Erk)、胰岛素受体底物-2 (IRS-2).磷酸化丝氨酸-苏氨酸激酶(P-Akt)、磷酸化-丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、磷酸化内皮一氧化氮合酶(P-eNOS)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达。制备下肢缺血模型第4天采集样本,做western Blot来检测CatS基因敲除小鼠和野生型小鼠的各种蛋白表达。结果显示：CatS基因敲除小鼠与野生型小鼠比较,缺血骨骼肌中PPAR-γ、IRS-2、P-Akt、P-Erk、P-P38MAPK、P-GSK、P-eNOS、VEGF的蛋白表达明显降低。3.组织蛋白酶S的siRNA组细胞的浸润、增殖和成小管化功能减退的机制与PPARγ、p-Erk、IRS-2、p-Akt、p-p38MAPK、P-eNOS和VEGF水平的降低有关。为了进一步证实CatS在血管再生中的作用,利用基因沉默(siRNA),使CatS的表达降低。为了证实这一结果我们用western Blot检测CatS和CatK的活性。结果表明：CatS的siRNA的表达明显低于对照组,而对组织蛋白酶K的表达无明显影响。将CatS的siRNA,转染给人脐静脉内皮细胞,做western来检测与血管再生相关的各种蛋白表达。在这图中可以看出CatS的siRNA组的PPARγ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-p38MAPK、p-GSK、p-eNOS、VEGF等与血管再生相关的蛋白表达明显降低。观察细胞的增殖功能结果表明：CatS的siRNA组与正常对照组比较,增殖的细胞数明显减少。进一步研究与血管再生相关的成小管化功能。用CatS干预的RNA组与未处理的正常对照组相比,管腔形成明显被抑制。4. CatS基因敲除小鼠来源的骨髓内皮祖细胞的与血管再生相关分子的蛋白以及磷酸化水平明显低于野生型小鼠来源的骨髓内皮祖细胞。做western来检测相关的蛋白,再次观察到CatS基因敲除小鼠来源的骨髓内皮祖细胞的PPAR-γ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和VEGF的蛋白水平明显低于野生型小鼠来源的骨髓内皮祖细胞。5.接受野生型小鼠骨髓移植,可以改善CatS基因敲除小鼠的血管再生功能。将野生型小鼠的骨髓,注入到CatS基因敲除的小鼠胫骨中；CatS基因敲除小鼠的骨髓注入到CatS基因敲除的小鼠胫骨中。结果显示：野生型小鼠的骨髓与CatS基因敲除的小鼠骨髓相比明显改善了缺血下肢血流。制备下肢缺血模型21天后,利用CD31免疫染色分析了毛细血管的形成,同样可以看出野生型小鼠的骨髓明显改善了毛细血管的形成。6. CatS抑制剂明显抑制下肢血流的恢复及毛细血管的形成。用激光多普勒超声血流仪检测下肢血流的动态变化。观察到术后即刻、术后1天血流明显下降,术后第4.天开始血流逐渐恢复,CatS抑制剂小鼠缺血下肢血流恢复明显慢于正常对照组。用CD31免疫染色重点分析了毛细血管的形成。观察到CatS基因敲除小鼠与正常对照组比较在缺血骨骼肌毛细血管形成明显受阻,CatS抑制剂小鼠的毛细血管密度明显低于正常对照组。7. CatS抑制剂明显影响动脉环的微管腔的形成。利用组织蛋白酶抑制剂做了对动脉环的微管腔形成的影响。可以看出选择性抑制剂和非选择性抑制剂,都明显影响了动脉环的微管腔的形成。8. CatS抑制剂影响与血管再生有关分子的蛋白及磷酸化水平的表达。选择性CatS抑制剂组的PPAR-γ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、 p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和VEGF的蛋白以及磷酸化表达与正常对照组比较明显降低。结论：CatS在缺血性血管再生中的作用可能是通过血管再生相关的信号蛋白对ECs/EPCs生物学行为的调控机制起作用,并可能通过PPAR-γ和VEGF/Akt信号通路起作用。组织蛋白酶S有望成为治疗缺血性心血管疾病的新的分子靶点。目的:组织蛋白酶K(CatlO是一个强有力的胶原酶参与人类和动物的动脉粥样硬化血管重建。本研巧测定CatK水平,并对CatK水平与CAD发病从及冠也病危险因素之间的关系进行分析。从而寻找新的、有临床意义的动脉粥样硬化斑块稳定相关的生物标志物。材料与方法:2011年月至2012年12月期间住院的患者经寇状动城造影后分为冠也病组256例和非冠也病姐129例。我们用免疫酶联吸附法测定了组织蛋白酶K、.自动生化分析仪测定髙密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白山化-0、糖化血红蛋白(HbAlC)、肌酌(Cr)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)等生化指标。统计学分析;计量资料文均数±碌准差表示,组间计量资料采用t俭验,组间计数资料采用卡方检验,冠也病与危险因素的关系采用多因素逐步回归分析。P0.05为差异有统计学。.结果:CAD患者蛋白酶K水平有明显髙于非冠也病组(130.85 ng/InL和86.9±25.5ng/mL,p0.001),急性冠脉综合征患者血清组织蛋白酶K水平明显高于稳定型也、绞痛组(137.1±26.9 ng/血和102.6±12.9 ng/.mL,p〈0.001)。隸性回归分析表明,组织蛋白酶K含虽与高密度脂蛋白水平呈负相关(r=-0.29,p0.01)和与hs-CKP水平呈正相关(T=0.32,p0.01)。多因素逐步回归分析表耽组织蛋白酶K水平是CAD的独立预测指标(优势比,1.76:95%置信区间,1-12至1.56;p〈0.01)。结论:本研究中发现冠心病病患者血清中组织蛋白酶K明显丹高,组织蛋白酶K与CAD的存在密切相关,有望成为动脉粥样硬化斑块稳定相关的生物标志物。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R541.4
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
Abbreviations
Chapter 1
    1.1 Introduction
    1.2 Materials and Methods
        1.2.1 Reagents
        1.2.2 Mice
        1.2.3 Model of hindlimb ischemia
        1.2.4 Analysis of hindlimb bloodflow
        1.2.5 Measurement of capillary density
        1.2.6 Western blotting
        1.2.7 Gelatin zymography
        1.2.8 Assay of collagenolytic activity
        1.2.9 Aorta-ring culture assay
        1.2.10 Analysis of EPCs
        1.2.11 BM transplantation
        1.2.12 Cell culture
        1.2.13 siRNA transfection protocol
        1.2.14 Cell proliferation assay
        1.2.15 Cell migration and invasion assays
        1.2.16 EC tube formation assay
        1.2.17 Statistical analysis
    1.3. Results
-/-impaired the blood flow recovery and capillary formation in response toischemia'>        1.3.1 CatS^-/-impaired the blood flow recovery and capillary formation in response toischemia
        1.3.2 Acute hypoxic stress induced Cat expression and activity
-/-attenuated the ischemic stress-induced IRS-2/PPAR-γ and VEGF-inducedErk1/2/p38MAPKsignaling activation'>        1.3.3 CatS^-/-attenuated the ischemic stress-induced IRS-2/PPAR-γ and VEGF-inducedErk1/2/p38MAPKsignaling activation
        1.3.4 CatS was necessary and sufficicnt to modulate the targeted angiogenic signalingactivation and cellular functions in ECs
        1.3.5 CatS activity was required for EPC-mediated neovascularization
+/+ BM rescued the neovascularization in CatS^-/- mice'>        1.3.6 CatS^+/+ BM rescued the neovascularization in CatS^-/- mice
        1.3.7 CatS inhibition diminished ischermia-induced neovascularization
-/- mice'>        1.3.8 Reduced inflammatory action in the CatS^-/- mice
    1.4. Discussion
    1.5. Condusions
    References
Chapter 2
    2.1. Introduction
    2.2. Materials and methods
        2.2.1 Study population and definition
        2.2.2 Laboratory examination
        2.2.3 Quantitative coronary angiogram（QCA）
        2.2.4 Statistical analysis
    2.3. Results
        2.3.1 Baseline clinical characteristics
        2.3.2 Atherosclerotic lesion location and characteristics
        2.3.3 Circulating biomarkers
        2.3.4 Independence of predictors of CAD
    2.4. Discussion
    2.5. Conclusions
    References
Review
    References
致谢
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本文编号：2892598