慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一组起源于骨髓造血干细胞的恶性增殖性血液系统肿瘤,其主要致病机制是9号染色体上的abl基因和22号染色体上的bcr基因断裂易位形成bcr-abl融合基因,该基因可以持续编码具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,从而形成严重威胁人类健康的重大疾病。酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼、达沙替尼等可特异性的抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活性,使慢性髓系白血病的治疗取得了长足进展。然而,仍然有部分CML恶性克隆残留在病人体内,从而导致部分患者出现复发或耐药。还有一部分患者对于酪氨酸激酶抑制剂存在不耐受的情况。因此,急需探索一种全新的治疗方法。目前,免疫疗法在肿瘤治疗中受到广泛关注。bcr-abl编码的BCR-ABL融合蛋白是慢性髓系白血病的遗传学标志,其抗原特异性限定在融合位点内。来源于BCR-ABL融合位点的抗原肽段GFKQSSKAL(GF),SSKALQRPV(SS)可以被MHC I类分子特异性递呈于CML细胞表面,因此该序列可以作为CML特异性抗原,是非常理想的免疫治疗理想靶标。已有研究证实,通过这些抗原负载DC,将外源性抗原递呈给CD8~+T淋巴细胞可以诱导CML特异性CTL应答。但由于外源性抗原经DC递呈效率不高,导致治疗效果不显著。因此,如何增强DC提呈外源性抗原的效率,提高CML治疗效果迫在眉睫。胞质转导肽(Cytoplasmic transduction peptide,CTP)是一种具有高效细胞胞质定位能力的肽段,包含11个氨基酸残基。这为外源性抗原的高效转导入胞核提供了可能性。在本研究中,我们运用胞质转导肽的高效转导能力,介导外源性BCR-ABL来源抗原肽段定位于DC胞质中,使外源性抗原内源化,经由MHC I类分子递呈至CD8~+T淋巴细胞,形成CML特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL),从而杀伤CML细胞。本实验旨在为CML免疫治疗提供理论基础和实验依据。采取的主要研究方法是:1.多肽的设计与合成及其定位效应观察。通过文献查阅,选择合适的BCR-ABL蛋白融合位点来源的抗原多肽,与改造后的CTP共同合成。体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞,将合成肽段与鼠源DC共同培养,通过直接荧光观测筛选出最佳肽段转导时间。之后,通过免疫荧光和激光共聚焦实验来观测合成肽段在DC中的定位情况,以探究合成的CTP肽段是否具有高效的胞质定位功能。2.CTP融合抗原对DC细胞毒性以及激发抗原交叉提呈效应的观察。用两段CTP融合肽段与DC分别以不同浓度共孵育不同时间,通过CCK-8来检测细胞的活力。用CTP-GF,CTP-SS,GF,SS分别以最佳浓度与DC共孵育,之后与新鲜提取CD8~+T淋巴细胞共培养,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对IL-2分泌量进行测定。3.CTP融合肽段介导免疫应答效能及其对BP210杀伤效应检测。设置CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,BLANK各实验组,分别将各组肽段与DC共培养后免疫小鼠,提取小鼠脾脏淋巴细胞。通过流式细胞术检测免疫后小鼠淋巴细胞增殖,活化以及脱颗粒能力;酶联免疫斑点实验(Enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)分析其分泌细胞因子能力;乳酸脱氢酶释放实验(Lactate dehydrogenase release assay,LDH release assay)检测效应T淋巴细胞对靶细胞的杀伤能力。4.CTP融合肽段对BP210细胞致小鼠白血病的免疫治疗效应和免疫记忆效应。先将BP210细胞通过尾静脉注射入七组小鼠体内。一周后将CTP-GF,CTP-SS,GF,SS,CTP,DC,Blank各组树突状细胞通过腹股沟注射免疫小鼠,每周一次,共免疫两次。记录各组小鼠生存状态,体重称量以及外周血白细胞计数;当小鼠出现跛行,后肢瘫痪,精神萎靡,体重快速下降时断颈处死,将肝脾进行称重拍照;取小鼠骨髓涂片,肝脾印片,瑞氏染色检查原始细胞浸润情况,免疫荧光法检查BCR-ABL的表达;将肝脾用4%多聚甲醛组织固定过夜,石蜡包埋,切片,HE染色观察肝脾中白血病细胞浸润情况;同时记录小鼠生存周期,比较存活时间。待免疫治疗观察期结束后,进行CTP融合肽段对BP210细胞二次攻击免疫记忆效应验证。重新设置Blank组,将BP210细胞通过尾静脉注射入4中实验组存活小鼠以及新设置Blank组小鼠体内。观察各组小鼠生存情况,实验检测方法同上文。取得的实验结果与结论如下:1.设计合成各组肽段,CTP融合肽段具有良好胞质定位能力。根据文献报道和实验需求,我们设计出相应肽段,并耦联FITC,添加HA标签。流式结果显示树突状细胞培养成功。直接荧光观测显示CTP融合肽段在浓度10μmol/L,孵育30 min可达到最佳转导效率。免疫荧光结果显示CTP融合肽段具有良好的胞质定位效能。激光共聚焦显微镜观测结果进一步证明CTP的胞质定位能力。2.CTP融合肽段具有良好生物安全性,成功刺激出交叉抗原提呈反应。CCK-8实验结果显示树突状细胞的生存不受CTP影响。ELISA实验结果显示,CTP融合肽段负载树突状细胞与淋巴细胞共培养,IL-2分泌水平更高,说明在此组交叉抗原提呈反应被成功刺激出,抗原提呈效率更高。3.CTP融合肽段免疫组T淋巴细胞增殖能力、活化能力、脱颗粒能力、细胞因子分泌能力以及靶细胞杀伤效应明显高于其他组。经由CTP融合肽段抗原负载树突状细胞能诱导出更有效的细胞免疫应答,从而杀伤BP210靶细胞。4.CTP融合肽段免疫的小鼠具有更长的生存时间,身体各项指标维持良好,HE染色检查肝脾骨髓检查白血病细胞的浸润情况明显好于其他各对照组。CTP融合肽段免疫小鼠,可以更好地刺激出CML特异性细胞免疫应答,对具有CML类似症状的小鼠具有相对良好的治疗效应。同时,肿瘤的二次攻击对CTP融合肽段组小鼠并没有影响,说明记忆性T淋巴细胞在小鼠体内存在,免疫记忆能力更强。综上所述,我们成功利用CTP介导BCR-ABL蛋白来源抗原多肽定位于树突状细胞胞质中,刺激树突状细胞交叉抗原提呈反应,将外源性抗原递呈至CD8~+T淋巴细胞,诱导CML特异性细胞免疫反应产生,从而杀伤BP210靶细胞。本课题首次从交叉抗原提呈的角度出发,将CTP引入慢性髓细胞白血病的免疫治疗,并初步取得了较好地实验结果,这可能为慢性髓细胞白血病患者提供一种全新的治疗策略。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R733.72
【部分图文】：
小鼠骨髓细胞经过GM-CSF和IL-4的刺激培养7天后,成功获得呈现“毛刺样”突起的细胞和细胞集落。经流式细胞术检测树突状细胞表面分子标志CD11c,CD86,MHC I以及MHC II,同时和新鲜骨髓细胞表面分子表达相比较,证实成功培养出骨髓来源树突状细胞,如图1-1(A,B),图1-1(C,D)。2.2 CTP融合肽段最佳转导效率筛选
为了能够观察CTP融合肽段的直接荧光,我们在合成肽段N端通过Acp耦联了FITC荧光。我们将FITC标记的CTP融合肽段分别按照2μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,10μmol/L,20μmol/L的浓度梯度与DC共培养,分别于15 min,30 min,60 min时收集细胞,然后直接在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。实验结果显示,CTP融合肽段在10μmol/L的浓度条件下,与DC共培养30 min时观察达到最高荧光强度(图1-2)。后续实验均按照此最佳浓度进行。2.3 CTP融合肽段定位于DC胞质
如前言所述,已有研究者在抗原负载途径方面进行了探索,PTD便是其中一种。然而,PTD不仅可以定位于胞质,还可以进入胞核,从而影响细胞生存,具有细胞毒性。因此,CTP的生物安全性需要得到验证,才能更好地进行试验。我们将CTP融合肽段与DC共培养,按照0μmol/L,4μmol/L,8μmol/L,16μmol/L,20μmol/L的浓度梯度分别共培养不同时间(0 h,24 h,48 h,72 h),用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞的存活率。实验结果显示,在不同浓度不同时间下,各组DC的存活率差异无显著的统计学意义,即CTP不会影响DC的生存,DC一直保持着较好的活性(图1-4A,图1-4B)。以上实验说明,CTP具有良好的生物安全性。2.5 CTP融合肽段增强DC抗原交叉提呈能力
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本文编号：
2892602
