人参皂苷Rg1对小鼠骨髓内皮祖细胞体外增殖的影响及其作用机制的研究
发布时间：2021-01-25 06:51
目的建立小鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）系作为细胞模型,采用RNA-seq技术结合生物信息学手段,分析人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）对小鼠骨髓EPCs增殖影响的差异表达基因及其主要意义,探讨人参皂苷Rg1对小鼠骨髓EPCs促增殖作用的分子机制,为利用人参皂苷Rg1治疗内皮损伤性疾病提供分子生物学水平依据,同时寻找促进EPCs体外生长的关键靶点,为培养数量充足、富有活力的EPCs提供新思路。方法1.采用全骨髓差速贴壁培养法与二次酶消化法相结合,分离和纯化小鼠骨髓EPCs。通过形态学观察、细胞表面抗原表达率检测,进行所获EPCs的细胞鉴定。2.在EPCs的传代培养过程中,选择增殖能力强的细胞,通过有限稀释培养获得单克隆细胞系,并进行传代培养扩增。通过形态学观察、生长特性观察、细胞表面抗原检测、核型分析、体外成血管实验,进行所建细胞系MBMME2的鉴定。3.取小鼠骨髓EPCs的传代细胞和细胞系MBMME2细胞,每种细胞分为7个组,即4个人参皂苷Rg1处理组（终浓度分别为5、10、15、20μmol/L）,空白对照组、溶...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
EPCs的鉴定方法[36]
已有研究表明,人参提取物能竞争性与雌二醇、孕激素结合到后两者受体位点上。人参皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1和Rc均具有雌激素样作用[132]。Chao等在2002年以人乳腺癌细胞株研究人参皂苷Rg1的雌激素活性及其作用机制[133]。发现的浓度在10-15-10-7mol/L范围内的人参皂苷Rg1对MCF-7的增殖呈剂量依赖关系,并且最佳浓度为3×10-13mol/L。但是这种增殖能被特异的雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-6mol/L)所抑制。因此认为人参皂苷Rg1具有雌激素样活性,此外,人参皂苷Rg1能诱导雌激素调节基因p S2的表达。也有研究显示:人参皂苷Rg1(1-100μg/mL)对B16F10和HUVEC细胞生长无显著影响,但可以显著促进CAM一级血管生成,对二级血管有不同程度的促进作用,腹腔注射人参皂苷Rg1,荷瘤鼠肿瘤体积抑制率为13.8%,瘤血管生成增殖率为18.1%,表明人参皂苷Rg1对荷瘤小鼠具有免疫增强活性[134]。Gao等认为人参皂苷Rg1在ER阳性细胞中可能的作用机制是通过形成含有小窝蛋白Caveolin、连接蛋白Shc、雌激素受体非基因组调节因子MNAR(modulator of nongenomic activity of ER)、胰岛素样生长因子受体IGFR(insulin-like growth factor-I receptor)和c-Src(cellular nonreceptor tyrosine kinase)的信号小体,激活ERα募集到质膜,并诱导细胞内Ca2+动员增加,然后激活G蛋白偶联雌激素受体Gper-EGFR,诱导细胞内c AMP的增加;在Ser118处引起MEK1/2磷酸化和ERα磷酸化,然后诱导ERE依赖型转录,最后激活雌激素受体效应[135]。人参皂苷Rg1对ER阳性细胞可能的作用机制如图1-2所示。相关研究结果显示人参皂苷Rg1具有维持CNS刺激功能、抗疲劳、抗高血压和增强智力的作用[105,128-129]。人参皂苷Rg1通过不同通路作用于不同的靶点,起着不同的作用;其可以通过细胞因子-细胞因子受体相互作用;MAPK信号通路,Toll样受体信号通路、花生四烯酸代谢、细胞凋亡等信号通路进行调节[47,101,111,115-116]。通过这些信号通路与信号转导、环境、信息处理,信号分子之间的相互作用,影响细胞生长和凋亡、脂质代谢等。
小鼠骨髓单个核细胞接种入25 mL塑料培养瓶,倒置显微镜下观察到细胞呈圆形,大多悬浮在培养液中,少量沉入瓶壁。培养2 h左右,可见有少量细胞贴壁,形态开始发生改变,由圆形变为不规则多边形。随着培养时间延长,贴壁细胞不断增多。体外培养48 h内贴壁的细胞培养至亚融合状态时,大多呈成纤维细胞样的长梭形,少量呈短梭形(图2-1-A)。这些长梭形细胞主要是间充质干细胞扩增细胞,而短梭形细胞主要为内皮祖细胞扩增细胞。开始培养后第二个48h期间(第49~96 h)贴壁的细胞培养至亚融合状态时,大多呈短梭形、圆形或多边形,长梭形细胞很少(2-1-B)。当上述第49~96 h期间贴壁细胞生长至亚融合状态时,经二次酶消化法处理,将第二次酶消化获取的细胞做传代培养。细胞贴壁生长后,大多呈鹅卵石形、短梭形、三角形或圆形。在较低密度时,很多细胞排列成条索样(图2-2-A,B)。在较高密度时,细胞呈铺路石样排列(图2-2-C,D)。由此可见,这些细胞具有体外培养条件下EPCs扩增细胞的典型形态学特征。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠肝损伤、氧化应激及肝组织Toll样受体4表达的影响[J]. 陈羡人,高雅文,邓小梅. 中国临床药理学杂志. 2020(02)
[2]中药对内皮祖细胞功能影响的研究进展[J]. 胡珍,徐赟晟,覃小燕,樊官伟,张晗,毛静远,高秀梅. 中华中医药学刊. 2019(04)
[3]人参皂苷Rg1对骨髓来源内皮祖细胞损伤的保护作用[J]. 蒋文捷,梁雪梅. 中国组织工程研究. 2018(33)
[4]内皮细胞损伤与修复的研究进展[J]. 饶璇,李元建. 中国动脉硬化杂志. 2017(05)
[5]人参皂苷Rg1通过PI3K/Akt/eNOS信号通路调控异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[J]. 冷雪,臧安缘,李其芳. 中国实验方剂学杂志. 2017(11)
[6]不同浓度雌激素对急性期高血压脑出血患者的内皮祖细胞功能及衰老的影响[J]. 杨莹莹,陈秋娟,袁文,夏小辉. 山西医药杂志. 2017(03)
[7]人参皂苷Rg1对体外胚鼠皮层神经干细胞的增殖和神经胶质定向分化的影响[J]. 田沫,万凤,高健,刘峻崎,李渊渊,张丽娟,司银楚. 中华中医药杂志. 2016(11)
[8]Roles and mechanisms of ginsenoside in cardiovascular diseases: progress and perspectives[J]. Yingying Sun,Yue Liu,Keji Chen. Science China（Life Sciences）. 2016(03)
[9]人参皂苷Rg1对成体干细胞特性与功能的影响[J]. 何方,余丽梅. 中国药理学通报. 2016(03)
[10]人参皂苷Rg1促血管再生作用的研究进展[J]. 张庆勇,朱武飞,罗春华. 广东医学. 2015(08)
博士论文
[1]人参皂苷Rg1调控经典Wnt信号通路延缓造血干/祖细胞衰老的机制研究[D]. 李静.重庆医科大学 2017
[2]人参皂苷Rg1调控FoxO3a相关信号通路抑制人脐血源基质细胞氧化应激损伤的研究[D]. 刘颖.重庆医科大学 2017
[3]人参皂苷Rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗的实验研究[D]. 李俊.第二军医大学 2016
[4]人参及其皂苷对黑色素瘤与血管生成的影响[D]. 郑斯文.中国农业科学院 2016
[5]人参皂苷Rg1和Re通过TLR4通路发挥免疫调节及抗内毒素作用[D]. 苏菲.浙江大学 2015
[6]人参皂苷Rg1延长C57BL/6J小鼠寿命及延缓脑老化的机制研究[D]. 杨璐萌.福建医科大学 2013
[7]人参皂苷Rg1促进糖尿病小鼠缺血肢体血管新生的研究[D]. 杨乃全.南京医科大学 2013
[8]雌激素膜受体所介导的PI（3）K传导通路激活在内皮祖细胞增殖和迁移中的作用[D]. 张文夺.复旦大学 2005
硕士论文
[1]西格列汀对高糖刺激下大鼠骨髓内皮祖细胞增殖、迁移功能影响及机制研究[D]. 徐丹丹.郑州大学 2014
[2]人参皂苷Rg1对人脐血CD34+造血干细胞增殖分化及钙敏感受体的影响[D]. 潘丽.遵义医学院 2011
[3]丹参多酚酸盐对体外培养的人外周血内皮祖细胞增殖、粘附及NO分泌功能影响的研究[D]. 严凤娣.扬州大学 2008
[4]辛伐他汀对内皮祖细胞增殖、迁移、凋亡及黏附影响的研究[D]. 杨乃全.南京医科大学 2008
[5]吡格列酮对外周血内皮祖细胞数量与增殖能力的影响[D]. 周文静.浙江大学 2008
本文编号：2998784
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
EPCs的鉴定方法[36]
已有研究表明,人参提取物能竞争性与雌二醇、孕激素结合到后两者受体位点上。人参皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1和Rc均具有雌激素样作用[132]。Chao等在2002年以人乳腺癌细胞株研究人参皂苷Rg1的雌激素活性及其作用机制[133]。发现的浓度在10-15-10-7mol/L范围内的人参皂苷Rg1对MCF-7的增殖呈剂量依赖关系,并且最佳浓度为3×10-13mol/L。但是这种增殖能被特异的雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-6mol/L)所抑制。因此认为人参皂苷Rg1具有雌激素样活性,此外,人参皂苷Rg1能诱导雌激素调节基因p S2的表达。也有研究显示:人参皂苷Rg1(1-100μg/mL)对B16F10和HUVEC细胞生长无显著影响,但可以显著促进CAM一级血管生成,对二级血管有不同程度的促进作用,腹腔注射人参皂苷Rg1,荷瘤鼠肿瘤体积抑制率为13.8%,瘤血管生成增殖率为18.1%,表明人参皂苷Rg1对荷瘤小鼠具有免疫增强活性[134]。Gao等认为人参皂苷Rg1在ER阳性细胞中可能的作用机制是通过形成含有小窝蛋白Caveolin、连接蛋白Shc、雌激素受体非基因组调节因子MNAR(modulator of nongenomic activity of ER)、胰岛素样生长因子受体IGFR(insulin-like growth factor-I receptor)和c-Src(cellular nonreceptor tyrosine kinase)的信号小体,激活ERα募集到质膜,并诱导细胞内Ca2+动员增加,然后激活G蛋白偶联雌激素受体Gper-EGFR,诱导细胞内c AMP的增加;在Ser118处引起MEK1/2磷酸化和ERα磷酸化,然后诱导ERE依赖型转录,最后激活雌激素受体效应[135]。人参皂苷Rg1对ER阳性细胞可能的作用机制如图1-2所示。相关研究结果显示人参皂苷Rg1具有维持CNS刺激功能、抗疲劳、抗高血压和增强智力的作用[105,128-129]。人参皂苷Rg1通过不同通路作用于不同的靶点,起着不同的作用;其可以通过细胞因子-细胞因子受体相互作用;MAPK信号通路,Toll样受体信号通路、花生四烯酸代谢、细胞凋亡等信号通路进行调节[47,101,111,115-116]。通过这些信号通路与信号转导、环境、信息处理,信号分子之间的相互作用,影响细胞生长和凋亡、脂质代谢等。
小鼠骨髓单个核细胞接种入25 mL塑料培养瓶,倒置显微镜下观察到细胞呈圆形,大多悬浮在培养液中,少量沉入瓶壁。培养2 h左右,可见有少量细胞贴壁,形态开始发生改变,由圆形变为不规则多边形。随着培养时间延长,贴壁细胞不断增多。体外培养48 h内贴壁的细胞培养至亚融合状态时,大多呈成纤维细胞样的长梭形,少量呈短梭形(图2-1-A)。这些长梭形细胞主要是间充质干细胞扩增细胞,而短梭形细胞主要为内皮祖细胞扩增细胞。开始培养后第二个48h期间(第49~96 h)贴壁的细胞培养至亚融合状态时,大多呈短梭形、圆形或多边形,长梭形细胞很少(2-1-B)。当上述第49~96 h期间贴壁细胞生长至亚融合状态时,经二次酶消化法处理,将第二次酶消化获取的细胞做传代培养。细胞贴壁生长后,大多呈鹅卵石形、短梭形、三角形或圆形。在较低密度时,很多细胞排列成条索样(图2-2-A,B)。在较高密度时,细胞呈铺路石样排列(图2-2-C,D)。由此可见,这些细胞具有体外培养条件下EPCs扩增细胞的典型形态学特征。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人参皂苷Rg1对糖尿病大鼠肝损伤、氧化应激及肝组织Toll样受体4表达的影响[J]. 陈羡人,高雅文,邓小梅. 中国临床药理学杂志. 2020(02)
[2]中药对内皮祖细胞功能影响的研究进展[J]. 胡珍,徐赟晟,覃小燕,樊官伟,张晗,毛静远,高秀梅. 中华中医药学刊. 2019(04)
[3]人参皂苷Rg1对骨髓来源内皮祖细胞损伤的保护作用[J]. 蒋文捷,梁雪梅. 中国组织工程研究. 2018(33)
[4]内皮细胞损伤与修复的研究进展[J]. 饶璇,李元建. 中国动脉硬化杂志. 2017(05)
[5]人参皂苷Rg1通过PI3K/Akt/eNOS信号通路调控异丙肾上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用[J]. 冷雪,臧安缘,李其芳. 中国实验方剂学杂志. 2017(11)
[6]不同浓度雌激素对急性期高血压脑出血患者的内皮祖细胞功能及衰老的影响[J]. 杨莹莹,陈秋娟,袁文,夏小辉. 山西医药杂志. 2017(03)
[7]人参皂苷Rg1对体外胚鼠皮层神经干细胞的增殖和神经胶质定向分化的影响[J]. 田沫,万凤,高健,刘峻崎,李渊渊,张丽娟,司银楚. 中华中医药杂志. 2016(11)
[8]Roles and mechanisms of ginsenoside in cardiovascular diseases: progress and perspectives[J]. Yingying Sun,Yue Liu,Keji Chen. Science China（Life Sciences）. 2016(03)
[9]人参皂苷Rg1对成体干细胞特性与功能的影响[J]. 何方,余丽梅. 中国药理学通报. 2016(03)
[10]人参皂苷Rg1促血管再生作用的研究进展[J]. 张庆勇,朱武飞,罗春华. 广东医学. 2015(08)
博士论文
[1]人参皂苷Rg1调控经典Wnt信号通路延缓造血干/祖细胞衰老的机制研究[D]. 李静.重庆医科大学 2017
[2]人参皂苷Rg1调控FoxO3a相关信号通路抑制人脐血源基质细胞氧化应激损伤的研究[D]. 刘颖.重庆医科大学 2017
[3]人参皂苷Rg1改善氧化应激引起的糖皮质激素抵抗的实验研究[D]. 李俊.第二军医大学 2016
[4]人参及其皂苷对黑色素瘤与血管生成的影响[D]. 郑斯文.中国农业科学院 2016
[5]人参皂苷Rg1和Re通过TLR4通路发挥免疫调节及抗内毒素作用[D]. 苏菲.浙江大学 2015
[6]人参皂苷Rg1延长C57BL/6J小鼠寿命及延缓脑老化的机制研究[D]. 杨璐萌.福建医科大学 2013
[7]人参皂苷Rg1促进糖尿病小鼠缺血肢体血管新生的研究[D]. 杨乃全.南京医科大学 2013
[8]雌激素膜受体所介导的PI（3）K传导通路激活在内皮祖细胞增殖和迁移中的作用[D]. 张文夺.复旦大学 2005
硕士论文
[1]西格列汀对高糖刺激下大鼠骨髓内皮祖细胞增殖、迁移功能影响及机制研究[D]. 徐丹丹.郑州大学 2014
[2]人参皂苷Rg1对人脐血CD34+造血干细胞增殖分化及钙敏感受体的影响[D]. 潘丽.遵义医学院 2011
[3]丹参多酚酸盐对体外培养的人外周血内皮祖细胞增殖、粘附及NO分泌功能影响的研究[D]. 严凤娣.扬州大学 2008
[4]辛伐他汀对内皮祖细胞增殖、迁移、凋亡及黏附影响的研究[D]. 杨乃全.南京医科大学 2008
[5]吡格列酮对外周血内皮祖细胞数量与增殖能力的影响[D]. 周文静.浙江大学 2008
本文编号：2998784
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