利用基因编辑和干细胞技术进行人胰腺分化及糖尿病预防和治疗研究
发布时间：2021-02-28 12:45
糖尿病是一种世界范围内高发的代谢性疾病,患者体内的胰岛β细胞缺失或功能障碍导致胰岛素分泌不足,进而诱发慢性高血糖症。因此,在体外产生大量有功能的胰岛β细胞对于胰腺发育学研究和糖尿病治疗至关重要。近期的研究报道了很多具有前景的研究方案,其中包括由人多能干细胞向胰岛β细胞的定向分化法。通过对定向分化体系的优化,我们获得了大量有功能的胰岛β细胞。这些细胞高表达胰岛β细胞的标志基因、具有胰岛素分泌囊泡的亚显微结构且可以感应葡萄糖浓度的变化来分泌胰岛素,并且具有一定的体内功能,因而在疾病建模、药物开发和细胞治疗等方面有广阔的应用前景。精准的基因编辑有助于高效地构建疾病模型。然而,在人多能干细胞中进行精准的基因编辑仍然非常耗时耗力。CRISPR-Cpf1是新开发的一种基因编辑工具酶,具有很多独特的优势,包括具有较短的crRNA和低脱靶率等。因此,在人多能干细胞中开发基于CRISPR-Cpf1的精准基因编辑系统具有十分广阔的应用前景。而化学小分子具有使用简便、高效以及非整合等特点,可以用于提高基因编辑效率。在这里,我们在人多能干细胞中构建了 CRISPR-Cpf1基因编辑体系,并且开发了一种无偏好的...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１真核细胞中主要的ＤＮＡ断裂修复方式（引自参考文献Ｗ）
浙江繼博士雜齡．?１?ｇ［Ｒ??ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ??？一?ｘ?（ＺＦ?ｏｒ?ＴＡＬＥ）??Ｆ〇ｋ！＿?ｚｆ?ｕｍｎｎｕｎ＾??…?Ｆｏｋ丨?一?－，）?ＴＡＬＥ??图１．２?ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ的工作模式图（引自参考文献叫９??随后，研究者们依旧不断致力于寻找新的基因编辑工具。２０１３年，研究人员??在ＩＩ型细菌的适应性免疫系统ＣＲＩＳＰＲ中开发出了?Ｃａｓ９核酸酶［１３、１４］，从此，基??因编辑工具得到了广泛的应用。ＣＲＩＳＰＲ基因编辑系统的开发和使用是基因编辑??领域中里程碑式的进展，为生物学基础研究和临床治疗提供了强大的分子工具。??１．１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编辑系统??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编辑系统包含Ｃａｓ９核酸酶以及两个非编码的ＣＲＩＳＰＲ单??链ＲＮＡ［ｌ３ｌ（图１．３?）。单链ＲＮＡ系统由反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）和前体ｃｒＲＮＡ??（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）两部分组成，其中前体ｃｒＲＮＡ包含核酸酶定位序列（ｇＲＮＡ）和??直接重复序列（ＤＲ）。ｇＲＮＡ可以与基因组上前间区序列临近基序（ＰＡＭ）前的??特定序列结合，引导Ｃａｓ９核酸酶定位到基因组上。Ｃａｓ９核酸酶识别ＰＡＭ序列??（ＮＧＧ）之后造成ＤＮＡ的双链断裂，从而引发细胞内源的ＤＮＡ修复。其中，??通过非同寐末端连接方式进Ｉｆ的ＤＮＡ修复会导致．基因組小片段插入或缺失，进??而产生基因突交或敲除的细胞系，而通过同源重组方式修复基因组可以用来构建??基因敲入的细胞系心１６］。??３??
浙江大学博士学雜文?１?ｇ丨Ｒ??Ｃａｓ９??ＤＮＡ??ｌ?ｔｅｍｐｌａｔｅ?ｓｔｒａｎｄ?ＰＡＭ??｜Ｎｏｎ?ｔｅｍｐｌａｔｅｌ??＿！Ｊ?ｓｇＲＮＡ??图１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的工作模式图（引自参考文献【１？１）。??１．１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ基因编辑系统??２０１５年，张峰实验室报道了新型基因编辑工具酶ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ（图１．４）［１８］。??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可以识别富含胸腺嘧啶（Ｔ）的ＰＡＭ序列，区别于ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??识别的“ＮＧＧ”ＰＡＭ序列，扩大了?ＲＮＡ介导的基因编辑的范围。此外，不同于??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９造成的ＤＮＡ平末端断裂，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ造成ＤＮＡ双链断裂后产??生５?ｎｔ的粘性末端。因此，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可能会带来不同的ＤＮＡ修复机制？。??值得一提的是，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的单链ＲＮＡ系统不包含ｔｒａｃｒＲＮＡ，所以长度明显??短于ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的单链ＲＮＡ长度，因此ｃｒＲＮＡ更适于体外合成和多基因编??辑。而且ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的脱靶率较低，非常利：于在细胞中进行精准的基因编辑??［２０－２２］??〇??４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]诱导多能干细胞的临床应用研究[J]. 瞿超,李劲松. 中国细胞生物学学报. 2018(S1)
[2]基因编辑技术:进展与挑战[J]. 卢俊南,褚鑫,潘燕平,陈映羲,温栾,戴俊彪. 中国科学院院刊. 2018(11)
[3]人类基因编辑的前景与挑战[J]. 李卓,吴景淳,裴端卿. 生命科学. 2018(09)
[4]中国2型糖尿病防治指南（2017年版）[J]. Chinese Diabetes Society;. 中国实用内科杂志. 2018(04)
[5]基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战[J]. 王福军,赵开军. 中国农业科学. 2018(01)
[6]诱导重编程的表观遗传调控研究进展[J]. 李东伟,陈捷凯,裴端卿. 生命科学. 2017(10)
[7]什么控制着器官再生?[J]. 裴端卿. 科学通报. 2017(Z2)
[8]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅. 生物工程学报. 2017(03)
[9]CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用[J]. 孟泽松,王飞飞,王光林,席金川,王贵英. 肿瘤. 2016(12)
[10]干细胞与再生医学发展前瞻[J]. 刘晶,曹尚涛,蔡景蕾,裴端卿. 科技导报. 2016(20)
本文编号：3055870
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．１真核细胞中主要的ＤＮＡ断裂修复方式（引自参考文献Ｗ）
浙江繼博士雜齡．?１?ｇ［Ｒ??ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ??？一?ｘ?（ＺＦ?ｏｒ?ＴＡＬＥ）??Ｆ〇ｋ！＿?ｚｆ?ｕｍｎｎｕｎ＾??…?Ｆｏｋ丨?一?－，）?ＴＡＬＥ??图１．２?ＺＦＮ和ＴＡＬＥＮ的工作模式图（引自参考文献叫９??随后，研究者们依旧不断致力于寻找新的基因编辑工具。２０１３年，研究人员??在ＩＩ型细菌的适应性免疫系统ＣＲＩＳＰＲ中开发出了?Ｃａｓ９核酸酶［１３、１４］，从此，基??因编辑工具得到了广泛的应用。ＣＲＩＳＰＲ基因编辑系统的开发和使用是基因编辑??领域中里程碑式的进展，为生物学基础研究和临床治疗提供了强大的分子工具。??１．１．２?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编辑系统??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因编辑系统包含Ｃａｓ９核酸酶以及两个非编码的ＣＲＩＳＰＲ单??链ＲＮＡ［ｌ３ｌ（图１．３?）。单链ＲＮＡ系统由反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）和前体ｃｒＲＮＡ??（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）两部分组成，其中前体ｃｒＲＮＡ包含核酸酶定位序列（ｇＲＮＡ）和??直接重复序列（ＤＲ）。ｇＲＮＡ可以与基因组上前间区序列临近基序（ＰＡＭ）前的??特定序列结合，引导Ｃａｓ９核酸酶定位到基因组上。Ｃａｓ９核酸酶识别ＰＡＭ序列??（ＮＧＧ）之后造成ＤＮＡ的双链断裂，从而引发细胞内源的ＤＮＡ修复。其中，??通过非同寐末端连接方式进Ｉｆ的ＤＮＡ修复会导致．基因組小片段插入或缺失，进??而产生基因突交或敲除的细胞系，而通过同源重组方式修复基因组可以用来构建??基因敲入的细胞系心１６］。??３??
浙江大学博士学雜文?１?ｇ丨Ｒ??Ｃａｓ９??ＤＮＡ??ｌ?ｔｅｍｐｌａｔｅ?ｓｔｒａｎｄ?ＰＡＭ??｜Ｎｏｎ?ｔｅｍｐｌａｔｅｌ??＿！Ｊ?ｓｇＲＮＡ??图１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的工作模式图（引自参考文献【１？１）。??１．１．３?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ基因编辑系统??２０１５年，张峰实验室报道了新型基因编辑工具酶ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ（图１．４）［１８］。??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可以识别富含胸腺嘧啶（Ｔ）的ＰＡＭ序列，区别于ＣＲ１ＳＰＲ－Ｃａｓ９??识别的“ＮＧＧ”ＰＡＭ序列，扩大了?ＲＮＡ介导的基因编辑的范围。此外，不同于??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９造成的ＤＮＡ平末端断裂，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ造成ＤＮＡ双链断裂后产??生５?ｎｔ的粘性末端。因此，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ可能会带来不同的ＤＮＡ修复机制？。??值得一提的是，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的单链ＲＮＡ系统不包含ｔｒａｃｒＲＮＡ，所以长度明显??短于ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９的单链ＲＮＡ长度，因此ｃｒＲＮＡ更适于体外合成和多基因编??辑。而且ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆｌ的脱靶率较低，非常利：于在细胞中进行精准的基因编辑??［２０－２２］??〇??４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]诱导多能干细胞的临床应用研究[J]. 瞿超,李劲松. 中国细胞生物学学报. 2018(S1)
[2]基因编辑技术:进展与挑战[J]. 卢俊南,褚鑫,潘燕平,陈映羲,温栾,戴俊彪. 中国科学院院刊. 2018(11)
[3]人类基因编辑的前景与挑战[J]. 李卓,吴景淳,裴端卿. 生命科学. 2018(09)
[4]中国2型糖尿病防治指南（2017年版）[J]. Chinese Diabetes Society;. 中国实用内科杂志. 2018(04)
[5]基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展与挑战[J]. 王福军,赵开军. 中国农业科学. 2018(01)
[6]诱导重编程的表观遗传调控研究进展[J]. 李东伟,陈捷凯,裴端卿. 生命科学. 2017(10)
[7]什么控制着器官再生?[J]. 裴端卿. 科学通报. 2017(Z2)
[8]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅. 生物工程学报. 2017(03)
[9]CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用[J]. 孟泽松,王飞飞,王光林,席金川,王贵英. 肿瘤. 2016(12)
[10]干细胞与再生医学发展前瞻[J]. 刘晶,曹尚涛,蔡景蕾,裴端卿. 科技导报. 2016(20)
本文编号：3055870
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