肺肿瘤细胞来源的外泌体对间充质干细胞的生物学影响及机制研究
发布时间：2021-04-01 05:01
研究背景肿瘤的发生和转移与肿瘤微环境密切相关。肿瘤微环境是由间充质干细胞、内皮细胞、免疫细胞、细胞外基质等共同构成的局部微环境。肿瘤细胞与肿瘤微环境的各种成分之间相互作用,相互影响,从而促进肿瘤的生长、转移、上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）、血管生成等。间充质干细胞（mesenchymal stem/stromal cells,MSCs）是一类成体干细胞,来源于骨髓、脂肪等体内多种组织,具有自我更新和成脂、成骨、成软骨等多系分化能力。MSCs还具有重要的免疫调节功能,能够抑制T细胞和B细胞的增殖,影响DC细胞的分化成熟。MSCs还可以被肿瘤细胞募集到肿瘤组织中,形成肿瘤微环境中的重要组成成分。肿瘤细胞可以通过细胞-细胞间的直接接触或者旁分泌的方式影响周围的细胞,从而促进肿瘤自身的生长和发展。外泌体（exosomes）是细胞分泌的一种囊泡结构,大小在30到100nm之间,由磷脂双分子层包裹形成。外泌体中含有大量功能性蛋白质、mRNA、miRNA、DNA片段等多种生物活性物质,可以介导细胞之间的物质转运和信息传递。越来越多的研究表明...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．?ｈＡＭＳＣｓ细胞形态与表型??Ａ．显微镜下ｈＡＭＳＣｓ细胞形态；Ｂ．?ｈＡＭＳＣｓ流式表型鉴定
二、ｈＡＭＳＣｓ向成骨分化及鉴定??在成骨分化诱导培养基中培养生长，在成骨诱导第３天进行碱性磷酸酶ＡＬＰ??染色，可以观察到ＡＬＰ染色阳性的成骨细胞（图２Ａ）。成骨诱导分化第１２天，出??现明显的细胞外基质的分泌和钙化沉积，使用茜素红染色呈现阳性（图２Ｂ）。分别??在成骨诱导的第０、３、６、９、１２天Ｔｒｉｚｏｌ收取ＲＮＡ样品，使用ｒｅａｌ?ｔｉｍｅ?ＰＣＲ法对??成骨分化标志性基因ｆｌ／ｐ、的表达情况进行检测。结果显示，随着成骨??诱导时间的推移，成骨分化关键转录因子及标志性基因的表达不断增加（图２Ｃ）。??表明ｈＡＭＳＣｓ可以被诱导分化形成成骨细胞。??Ａ?Ｃ?ａｌｐ?ｏｃｎ??１?］?Ｉ??＾?！：?ｙ??Ｂ?ｒｕｎｘ２??１０－１??－８－??＾?６＇??．?二纪＇、丨〇＂＊—ｉ?１?１?１?１—??４＞?＾?＾??图２?ｈＡＭＳＣｓ成骨分化染色及成骨相关基因表达检测??Ａ．成骨分化第３天ＡＬＰ染色；Ｂ．成骨分化第１２天茜素红染色；Ｃ．?ｒｅａ丨ｔｉｍｅ?ＰＣＲ??检测成骨分化过程中（第０、３、６、９、１２天）成骨分化标志性基因的表达。??标尺：２００｜ｉｍ。??２７??
更换为无血清ＤＦ１２培养基，培养２４？４８?ｈ后，收集培养上清，超速离心分离提取出??ｅｘｏｓｏｍｅｓ。透射电镜观察可见，适当浓度稀释后，我们可以观察到大量外膜深染的??圆形或类圆形微小囊泡小体，直径约为３０－１００?ｎｍ?（图４Ａ）。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ实验??也证实，这些微囊泡阳性表达ｅｘｏｓｏｍｅｓ的标志蛋白ＣＤ６３和ＨＳＰ７０?（图４Ｂ）。??Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａｌ?ｔｒａｃｋｉｎｇ?ａｎａｌｙｓｉｓ?（ＮＴＡ），纳米颗粒追踪分析（图４Ｃ）显不出ｅｘｏｓｏｍｅｓ??的直径分布范围，有三个峰值，分别在４４?ｎｍ、６９?ｎｍ和９５?ｎｍ，最大峰值为９５?ｎｍ，??平均直径在７３．１５?ｎｍ±４１．８１?ｎｍ，表明Ａ５４９细胞分泌的外泌体大小并不均一。??醒ｍ??－＊?．?？?．．．？?／，?ｎ．?．？ｃ?ｉ?ｆｉＢ??图４?Ａ５４９细胞来源的ｅｘｏｓｏｍｅｓｓ的鉴定结果??Ａ、Ａ５４９细胞来源的ｅｘｏｓｏｍｅｓ?透射电镜照片（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２００ｎｍ）；?Ｂ．?Ｅｘｏｓｏｍｅｓ??表面标志物ＣＤ６３、ＨＳＰ７０?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鉴定结果。Ａ５４９细胞裂解液用作阳性对照，??样品１上样量为１?ｕｇ，样品２上样量为ｌＯｕｇｃ＾ＣＮＴＡ分析显示ｅｘｏｓｏｍｅｓ的大小及分布。??２９??
本文编号：3112713
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．?ｈＡＭＳＣｓ细胞形态与表型??Ａ．显微镜下ｈＡＭＳＣｓ细胞形态；Ｂ．?ｈＡＭＳＣｓ流式表型鉴定
二、ｈＡＭＳＣｓ向成骨分化及鉴定??在成骨分化诱导培养基中培养生长，在成骨诱导第３天进行碱性磷酸酶ＡＬＰ??染色，可以观察到ＡＬＰ染色阳性的成骨细胞（图２Ａ）。成骨诱导分化第１２天，出??现明显的细胞外基质的分泌和钙化沉积，使用茜素红染色呈现阳性（图２Ｂ）。分别??在成骨诱导的第０、３、６、９、１２天Ｔｒｉｚｏｌ收取ＲＮＡ样品，使用ｒｅａｌ?ｔｉｍｅ?ＰＣＲ法对??成骨分化标志性基因ｆｌ／ｐ、的表达情况进行检测。结果显示，随着成骨??诱导时间的推移，成骨分化关键转录因子及标志性基因的表达不断增加（图２Ｃ）。??表明ｈＡＭＳＣｓ可以被诱导分化形成成骨细胞。??Ａ?Ｃ?ａｌｐ?ｏｃｎ??１?］?Ｉ??＾?！：?ｙ??Ｂ?ｒｕｎｘ２??１０－１??－８－??＾?６＇??．?二纪＇、丨〇＂＊—ｉ?１?１?１?１—??４＞?＾?＾??图２?ｈＡＭＳＣｓ成骨分化染色及成骨相关基因表达检测??Ａ．成骨分化第３天ＡＬＰ染色；Ｂ．成骨分化第１２天茜素红染色；Ｃ．?ｒｅａ丨ｔｉｍｅ?ＰＣＲ??检测成骨分化过程中（第０、３、６、９、１２天）成骨分化标志性基因的表达。??标尺：２００｜ｉｍ。??２７??
更换为无血清ＤＦ１２培养基，培养２４？４８?ｈ后，收集培养上清，超速离心分离提取出??ｅｘｏｓｏｍｅｓ。透射电镜观察可见，适当浓度稀释后，我们可以观察到大量外膜深染的??圆形或类圆形微小囊泡小体，直径约为３０－１００?ｎｍ?（图４Ａ）。通过Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ实验??也证实，这些微囊泡阳性表达ｅｘｏｓｏｍｅｓ的标志蛋白ＣＤ６３和ＨＳＰ７０?（图４Ｂ）。??Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａｌ?ｔｒａｃｋｉｎｇ?ａｎａｌｙｓｉｓ?（ＮＴＡ），纳米颗粒追踪分析（图４Ｃ）显不出ｅｘｏｓｏｍｅｓ??的直径分布范围，有三个峰值，分别在４４?ｎｍ、６９?ｎｍ和９５?ｎｍ，最大峰值为９５?ｎｍ，??平均直径在７３．１５?ｎｍ±４１．８１?ｎｍ，表明Ａ５４９细胞分泌的外泌体大小并不均一。??醒ｍ??－＊?．?？?．．．？?／，?ｎ．?．？ｃ?ｉ?ｆｉＢ??图４?Ａ５４９细胞来源的ｅｘｏｓｏｍｅｓｓ的鉴定结果??Ａ、Ａ５４９细胞来源的ｅｘｏｓｏｍｅｓ?透射电镜照片（Ｓｃａｌｅｂａｒ＝２００ｎｍ）；?Ｂ．?Ｅｘｏｓｏｍｅｓ??表面标志物ＣＤ６３、ＨＳＰ７０?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鉴定结果。Ａ５４９细胞裂解液用作阳性对照，??样品１上样量为１?ｕｇ，样品２上样量为ｌＯｕｇｃ＾ＣＮＴＡ分析显示ｅｘｏｓｏｍｅｓ的大小及分布。??２９??
本文编号：3112713
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