Gln转运载体ASCT2在肠屏障损伤修复中的功能和调控机制研究
发布时间：2021-04-19 02:11
[背景和目的]肠屏障损伤在许多疾病的发生发展和转归中发挥重要作用,其导致的微生物移位可引起严重的炎症反应,甚至导致死亡,尤其是在艾滋病（Acquired immune deficiency syndrome,AIDS）的进程中。艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染人体后首先攻击胃肠道,引起肠屏障损伤,进而导致微生物移位,微生物移位引起的免疫活化是增加非艾滋病相关并发症发生率,降低慢性感染期患者生活质量的主要原因,更是推动AIDS疾病进程加速患者死亡的重要因素。因此,开展肠道屏障损伤的分子机制研究,寻找肠屏障损伤修复的治疗靶点,对于提高患者生活质量,延缓疾病进程,延长患者生命,意义深远。谷氨酰胺（Glutamine,Gln）作为重要的免疫营养素,对肠黏膜屏障功能的维护至关重要,当谷氨酰胺缺乏时,会出现肠屏障功能严重受损,但是人们对受损肠粘膜的异常谷氨酰胺代谢知之甚少,丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体-2（Alanine,serine,cysteine-preferring transporter 2,ASCT2）是机体最重要的 Gln 转运载体...
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２．载体构建过程中的电泳验证
结果??１．肠黏膜上皮细胞ＣＣＣ－ＨＩＥ－２培养形态??细胞传代要注意汇合度，当汇合度小于５０％时进行传代，传代后细胞生长过??缓，不容易贴壁；但细胞传代时汇合度不能过大，当大于８０％时，传代后细胞死??细胞过多，最终确定最佳细胞传代汇合度为７０％。显微镜观察：细胞单层贴壁生??长，边界清楚，致密排列呈束状。??培养基的选择，细胞体外培养实验中，ＤＭＥＭ培养基效果好于１６４０，尽??管１６４０培养基ＣＣＣ－ＨＩＥ－２可以生长，但细胞形态偏瘦，不容易贴壁。图３为??ＤＭＥＭ培养基中ＣＣＣ－ＨＩＥ－２单个细胞及细胞单层在显微镜下的形态。可以看到，??在ＤＭＥＭ培养基中，单个细胞呈现比较健康的细长形态，贴壁良好。当细胞长??至９０％融合度时，可以形成单细胞层。??ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞?单层ＣＧＧ－ＨＩＥ－２细胞??图３．光学显微镜下观察ＣＣＣ－ＨＩＥ－２形态（放大倍数：１００ｘ）。左：单个细胞形??态；右：细胞层形态。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｕｎｄｅｒ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：?ｌＯＯｘ）．?Ｌｅｆｔ：??ｓｉｎｇｌｅ?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；?Ｒｉｇｈｔ：?ｃｅｌｌ?ｌａｙｅｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．??２．?ＬＰＳ损伤肠上皮细胞模型的建立??肠上皮细胞是构成肠粘膜的基本单元，是维持肠粘膜屏障的基础，肠上皮细??胞的异常凋亡将直接导致肠屏障损伤，研究发现ＬＰＳ进入肠道固有层引起肠粘??膜炎症、肠上皮细胞凋亡是导致肠屏障损伤的主要原因，艾滋病相关的肠屏障损??伤循环标记物的浓度只与ＬＰＳ依赖免疫激活的程度相关，与病毒载量无关，因??此我们通
２．１?ＬＰＳ导致ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞增殖能力下降??首先我们使用不同浓度的ＬＰＳ致损ＣＣＣ－Ｈｆｆｉ－２细胞，观察ＬＰＳ对细胞生长??的影响，并摸索导致细胞损伤的ＬＰＳ浓度，作为后续实验条件。??１５０－１??〇＞??泛?１００－??ｈｌｌｍ＊??ｓｆ?ｖｆ?ｖｆ?＾?＾??图４．?ＭＭＴ法检检测不同浓度ＬＰＳ对ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞增殖的影响。（＊Ｐ＜０．０５?＊＊Ｐ＜０．０１）??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?ＭＭＴ?ａｓｓａｙ?ｔｏ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＰＳ?ｏｎ?ｔｈｅ??ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｃｅｌｌｓ．?（＊Ｆ＜?０．０５?０．０１）??结果发现，与对照组相比，ｌＯＯｎｇ／ｍｌ?（尸＜０．０５）及１５０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）的ＬＰＳ??作用于ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞后，细胞出现了显著的增殖抑制。以１００ｎｇ／ｍｌ?ＬＰＳ作为??后续的实验条件。??２．２?ＬＰＳ促进ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞凋亡增加??为明确ＬＰＳ对ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞凋亡的影响，用１００?ｎｇ／ｍｌ的ＬＰＳ处理细胞??后，利用流式细胞术检测损伤细胞的凋亡情况。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＬＰＳ??罇＊?ｗ＞＂Ｔ??Ｑ１?Ｑ２?ｑｉ?Ｑ２??？０＊－??？ｃ１－??＊?■?ｉ?ｌ?ｉ?＜?１１｜?■?？?■?ｉ?ｔ－ｒ＊ｆ?９?？￣■?＊?＊＇？?■？！?？?？?＊?１?？?■?■?ｉｆ?Ｉ?ｉ?■－？＂ｎ?＿?■■?ｗ?■?Ｉｔ??？?？???????ｊ??ｉｅ°?？＊?？°?Ｍ＇
本文编号：3146618
【文章来源】：昆明医科大学云南省
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２．载体构建过程中的电泳验证
结果??１．肠黏膜上皮细胞ＣＣＣ－ＨＩＥ－２培养形态??细胞传代要注意汇合度，当汇合度小于５０％时进行传代，传代后细胞生长过??缓，不容易贴壁；但细胞传代时汇合度不能过大，当大于８０％时，传代后细胞死??细胞过多，最终确定最佳细胞传代汇合度为７０％。显微镜观察：细胞单层贴壁生??长，边界清楚，致密排列呈束状。??培养基的选择，细胞体外培养实验中，ＤＭＥＭ培养基效果好于１６４０，尽??管１６４０培养基ＣＣＣ－ＨＩＥ－２可以生长，但细胞形态偏瘦，不容易贴壁。图３为??ＤＭＥＭ培养基中ＣＣＣ－ＨＩＥ－２单个细胞及细胞单层在显微镜下的形态。可以看到，??在ＤＭＥＭ培养基中，单个细胞呈现比较健康的细长形态，贴壁良好。当细胞长??至９０％融合度时，可以形成单细胞层。??ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞?单层ＣＧＧ－ＨＩＥ－２细胞??图３．光学显微镜下观察ＣＣＣ－ＨＩＥ－２形态（放大倍数：１００ｘ）。左：单个细胞形??态；右：细胞层形态。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｕｎｄｅｒ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：?ｌＯＯｘ）．?Ｌｅｆｔ：??ｓｉｎｇｌｅ?ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；?Ｒｉｇｈｔ：?ｃｅｌｌ?ｌａｙｅｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．??２．?ＬＰＳ损伤肠上皮细胞模型的建立??肠上皮细胞是构成肠粘膜的基本单元，是维持肠粘膜屏障的基础，肠上皮细??胞的异常凋亡将直接导致肠屏障损伤，研究发现ＬＰＳ进入肠道固有层引起肠粘??膜炎症、肠上皮细胞凋亡是导致肠屏障损伤的主要原因，艾滋病相关的肠屏障损??伤循环标记物的浓度只与ＬＰＳ依赖免疫激活的程度相关，与病毒载量无关，因??此我们通
２．１?ＬＰＳ导致ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞增殖能力下降??首先我们使用不同浓度的ＬＰＳ致损ＣＣＣ－Ｈｆｆｉ－２细胞，观察ＬＰＳ对细胞生长??的影响，并摸索导致细胞损伤的ＬＰＳ浓度，作为后续实验条件。??１５０－１??〇＞??泛?１００－??ｈｌｌｍ＊??ｓｆ?ｖｆ?ｖｆ?＾?＾??图４．?ＭＭＴ法检检测不同浓度ＬＰＳ对ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞增殖的影响。（＊Ｐ＜０．０５?＊＊Ｐ＜０．０１）??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?ＭＭＴ?ａｓｓａｙ?ｔｏ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ?ｔｈｅ?ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ＬＰＳ?ｏｎ?ｔｈｅ??ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＣＣ－ＨＩＥ－２?ｃｅｌｌｓ．?（＊Ｆ＜?０．０５?０．０１）??结果发现，与对照组相比，ｌＯＯｎｇ／ｍｌ?（尸＜０．０５）及１５０ｎｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）的ＬＰＳ??作用于ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞后，细胞出现了显著的增殖抑制。以１００ｎｇ／ｍｌ?ＬＰＳ作为??后续的实验条件。??２．２?ＬＰＳ促进ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞凋亡增加??为明确ＬＰＳ对ＣＣＣ－ＨＩＥ－２细胞凋亡的影响，用１００?ｎｇ／ｍｌ的ＬＰＳ处理细胞??后，利用流式细胞术检测损伤细胞的凋亡情况。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＬＰＳ??罇＊?ｗ＞＂Ｔ??Ｑ１?Ｑ２?ｑｉ?Ｑ２??？０＊－??？ｃ１－??＊?■?ｉ?ｌ?ｉ?＜?１１｜?■?？?■?ｉ?ｔ－ｒ＊ｆ?９?？￣■?＊?＊＇？?■？！?？?？?＊?１?？?■?■?ｉｆ?Ｉ?ｉ?■－？＂ｎ?＿?■■?ｗ?■?Ｉｔ??？?？???????ｊ??ｉｅ°?？＊?？°?Ｍ＇
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