第一部分：APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究 第二部分：肿瘤抗原在食管鳞癌进展中

发布时间：2021-05-17 19:40

　　细胞分裂是由一系列精密调控的事件组成,而胞内代谢水平与细胞的生存状态紧密相关,因此细胞分裂的不同阶段会引发不同的代谢变化。E3泛素酶后期促进复合物（Anaphase-promoting Complex,APC/C）作为细胞周期重要的中心调控机制,与其共激活因子CDH1和CDC20共同催化周期相关蛋白及时降解,以保证细胞顺利分裂。然而,APC/C不仅调控细胞周期,还被发现能作用于PFKFB3以及GLS1,进而调控肿瘤细胞的糖酵解途径和谷氨酰胺代谢途径,提示APC/C具有连接细胞周期及肿瘤代谢的作用。本课题在2752个代谢酶和转运体中筛选同时含有APC/C结合序列KEN box和D box且在食管鳞癌测序数据中拷贝数变异频率超过20%的基因,得到17个可能受到APC/C调控的酶和转运体。由于APC/C对TCA循环的调控尚未被发现,而我们在食管鳞癌细胞中观察到三羧酸（Tricarboxylic acid cycle,TCA）循环的代谢产物α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）、延胡索酸及苹果酸与S期具有正相关关系,暗示了细胞周期与TCA循环的潜在联系。因此我们在17个候选蛋... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：170 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
第一部分 APC/C-CDH1调控的TCA循环代谢酶IDH3β促进细胞生长的机制研究
    中英文缩略词表
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 菌种、质粒和细胞株
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 引物合成与设计
            1.5 siRNA的合成
            1.6 主要仪器设备
            1.7 常用试剂的配置
        2. 实验方法
            2.1 细胞处理方法
            2.2 细胞瞬时转染
            2.3 细胞增殖实验
            2.4 细胞周期检测
            2.5 细胞克隆形成实验
            2.6 细胞周期同步化
            2.7 细胞药物处理
            2.8 细胞总蛋白和总RNA的提取
            2.9 细胞和RNA浓度测定
            2.10 Western blot
            2.11 胞膜-胞浆-胞核蛋白制备(参见说明书要求)
            2.12 逆转录与Real-time PCR
            2.13 细胞免疫荧光
            2.14 EDU增殖检测
            2.15 原位PLA检测
            2.16 质粒大量提取(按照说明书要求操作)
            2.18 免疫共沉淀实验
            2.19 裸鼠移植瘤实验
            2.20 TCA代谢产物检测
            2.21 稳定细胞系的筛选
            2.22 统计分析
    实验结果
        1. 筛选APC/C的潜在底物
        2. IDH3β是APC/C-CDH1的特异性结合底物
        3. APC/C-CDH1参与调控IDH3β的周期依赖性表达
        4. IDH3β调控食管鳞癌细胞G1/S期转换
        5. IDH3β促进管鳞癌细胞细胞增殖
        6. IDH3β作为IDH3的亚基之一能促进TCA循环的氧化代谢
        7. IDH3β依赖其催化产物α-KG来加快G1/S期转换并促进细胞增殖
        8. 过表达IDH3β上调PFKFB3的总蛋白以及在细胞核内的水平
        9. IDH3β在食管鳞癌组织中高表达并且与预后相关
        10. IDH3β在本研究中的主要功能模式图
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分 肿瘤抗原在食管鳞癌进展中的作用及分子机制研究
    中英文缩略词表
    中文摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 菌种、质粒和细胞株
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 引物合成与设计
            1.5 siRNA的合成
            1.6 主要仪器设备
            1.7 常用试剂的配置
        2. 实验方法
            2.1 细胞处理方法
            2.2 细胞瞬时转染
            2.3 细胞增殖实验
            2.4 细胞总蛋白和总RNA的提取
            2.5 细胞和RNA浓度测定
            2.6 逆转录与Real-time PCR
            2.7 胞膜-胞浆-胞核蛋白制备
            2.8 Western blot
            2.9 原位PLA检测
            2.10 细菌转化
            2.11 质粒大量提取
            2.12 免疫共沉淀实验
            2.13 裸鼠移植瘤实验
            2.14 小鼠尾静脉注射实验
            2.15 免疫组织化学实验
            2.16 稳定细胞系的筛选
            2.17 ELISA实验
            2.18 组织单个细胞分离
            2.19 人外周血淋巴细胞分离实验
            2.20 细胞杀伤实验
            2.21 T细胞活化及共培养(以单孔为例)
            2.22 细胞膜表面染色实验
            2.23 统计分析
    实验结果
        1. MAGE-C3在食管鳞癌中具有突变和拷贝数扩增现象
        2. MAGE-C3在食管鳞癌组织中高表达并且与预后负相关
        3. MAGE-C3促进食管鳞癌细胞的侵袭迁移但不影响肿瘤细胞生长
        4. 转录组测序分析
        5. MAGE-C3作用于IFN-γ受体激活IFN-γ通路
        6. MAGE-C3可上调PD-L1的mRNA水平和膜表面水平
        7. MAGE-C3抑制淋巴细胞杀伤以及T细胞的因子分泌功能
        8. MAGE-C3在免疫完全小鼠中促进黑色素瘤小鼠细胞生长和转移
        9. MAGE-C3影响黑色素瘤肺转移灶中肿瘤浸润T细胞的类型
        10. MAGE-C3可能通过STAT3诱导食管鳞癌EMT
        11. MAGE-C3在本研究中的主要功能模式图
    讨论
    结论
    参考文献
附录
基金资助
在读期间已发表或待发表的文章
肿瘤抗原MAGE的研究进展(文献综述）
    参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Cancer incidence and mortality in China, 2014[J]. Wanqing Chen,Kexin Sun,Rongshou Zheng,Hongmei Zeng,Siwei Zhang,Changfa Xia,Zhixun Yang,He Li,Xiaonong Zou,Jie He.  Chinese Journal of Cancer Research. 2018(01)



本文编号：3192331