无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤细胞诊断及靶向治疗中的应用研究
发布时间：2021-05-26 20:25
肿瘤是目前人类致死率最高的疾病之一。传统抗肿瘤药物往往存在靶向能力差、生物相容性差、代谢过快和毒副作用较强等缺点,因此在实际应用中受到了严重限制。此外,针对与肿瘤发生密切相关的肿瘤生物标志物进行检测是目前较为流行的肿瘤早期诊断手段,但这种方式对检测的灵敏度、特异性等都提出了极高的要求。基于以上问题,本文研究了多种无机纳米颗粒与核酸纳米材料在肿瘤标志物检测及肿瘤靶向治疗中的应用,设计和构建了用于检测肿瘤生物标志物端粒酶与miR-21的纳米生物传感器件,并通过研究细胞器靶向性和肿瘤靶向受体的精准排布探究了精确调控纳米颗粒肿瘤细胞靶向性的方法。本文的主要工作如下:（1）利用具有特定序列的端粒酶寡核苷酸引物,构建一系列纳米生物传感器,并将之应用于端粒酶提取物和活细胞内端粒酶的高灵敏度检测,实现了肿瘤细胞提取物内低至5个细胞的端粒酶检测,膀胱癌病人清尿与血尿样本的检出率分别达到100%和89.5%。此外,在肿瘤细胞内成功实现了端粒酶的实时荧光检测。（2）基于具有特殊荧光弛豫时间信号的荧光纳米金刚石（FND）与四氧化三铁磁性纳米颗粒（MNP）,制备了生物传感器FND-DNA-MNP,证实了其对肿瘤...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 无机纳米材料与肿瘤诊断
1.2.1 生物传感器概述
1.2.2 金纳米材料与肿瘤诊断
1.2.3 量子点与肿瘤诊断
1.2.4 纳米金刚石与肿瘤诊断
1.2.5 磁性纳米材料与肿瘤诊断
1.3 核酸纳米材料与肿瘤诊断
1.3.1 核酸纳米材料概述
1.3.2 核酸适配体与肿瘤诊断
1.3.3 核酸引物与肿瘤诊断
1.4 无机纳米材料与肿瘤治疗
1.4.1 金纳米材料与肿瘤治疗
1.4.2 硒纳米材料与肿瘤治疗
1.4.3 硅纳米材料与肿瘤治疗
1.5 核酸纳米材料与肿瘤治疗
1.5.1 DNA折纸结构与肿瘤治疗
1.5.2 核酸枝状大分子(Dendrimer)与肿瘤治疗
1.5.3 基于滚环扩增(RCA)的DNA纳米结构与肿瘤治疗
1.6 选题思路
第二章 检测端粒酶活性的DNA纳米传感器研究
2.1 引言
2.1.1 端粒酶与肿瘤诊断
2.1.2 聚集诱导发光(AIE)分子
2.1.3 本章研究目标
2.2 实验仪器与材料
2.2.1 实验试剂
2.2.2 实验仪器
2.3 实验方法与步骤
2.3.1 端粒酶提取
2.3.2 引物延伸反应
2.3.3 体系荧光测试
2.3.4 酶联免疫吸附(Elisa)测试
2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试
2.3.6 端粒酶延伸反应特异性测试
2.3.7端粒酶活性抑制实验
2.3.8 S1 核酸酶降解实验
2.3.9 细胞内端粒酶水平检测
2.4 结果与讨论
2.4.1 实验原理
2.4.2 AIE效应验证
2.4.3 端粒酶延伸反应条件优化
2.4.4 检测体系背景荧光优化
2.4.5 检测特异性对比
2.4.6 端粒酶提取物荧光响应测试
2.4.7 细胞内端粒酶活性检测
2.5 本章小结
第三章 基于荧光纳米金刚石的生物传感器设计及其应用
3.1 引言
3.1.1 MicroRNA与肿瘤诊断
3.1.2 荧光纳米金刚石概述
3.1.3 本章研究目标
3.2 实验仪器与材料
3.2.1 实验试剂
3.2.2 实验仪器
3.3 实验方法与步骤
3.3.1 双链制备
3.3.2 吸收、荧光光谱测定
3.3.3 FND-C1 的制备
3.3.4 MNP-C2 的制备
3.3.5 生物传感器FND-DNA-MNP的自组装
3.3.6 传感器对靶标miR-21 的响应
3.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试
3.3.8 动态光散射(DLS)表征颗粒粒径变化
3.3.9 纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)表征
3.3.10 荧光弛豫时间测试
3.4 结果与讨论
3.4.1 实验原理
3.4.2 链置换反应的荧光与凝胶电泳表征
3.4.3 自组装反应优化
3.4.4 FND与 MNP的投料比优化
3.4.5 传感器FND-DNA-MNP的表征
3.4.6 荧光弛豫时间表征
3.4.7 传感器对靶标miR-21 的原位响应表征
3.5 本章小结
第四章 基于DNA折纸技术探究肿瘤细胞靶向因子的最佳分布
4.1 引言
4.1.1 药物载体
4.1.2 转铁蛋白受体
4.1.3 DNA折纸纳米技术
4.1.4 本章研究目标
4.2 实验仪器与材料
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验仪器
4.3 实验方法与步骤
4.3.1 DNA折纸结构制备
4.3.2 DNA折纸结构纯化
4.3.3 生物素的NHS化修饰
4.3.4 转铁蛋白(Tf)的生物素化修饰
4.3.5 DNA折纸结构的转铁蛋白定点修饰
4.3.6 DNA折纸结构的Cy5 荧光基团杂交
4.3.7 琼脂糖凝胶电泳测试
4.3.8 DNA折纸结构的透射电子显微镜(TEM)表征
4.3.9 DNA折纸结构的原子力显微镜(AFM)表征
4.3.10细胞摄取实验
4.4 结果与讨论
4.4.1 实验原理
4.4.2 DNA折纸结构ONR的设计与表征
4.4.3 ONR-Tf结构的表征
4.4.4 ONR结构的Cy5 标记表征
4.4.5 不同ONR结构的细胞摄取效率对比
4.4.6 Tf-TfR识别过程抑制实验
4.5 本章小结
第五章 线粒体靶向无机硒纳米颗粒的抗肿瘤研究
5.1 引言
5.1.1 硒纳米颗粒
5.1.2 ROS与细胞凋亡
5.1.3 本章研究目标
5.2 实验仪器与材料
5.2.1 实验试剂
5.2.2 实验仪器
5.3 实验方法与步骤
5.3.1 HSA蛋白的TPP功能化修饰
5.3.2 HSA与 HSA-TPP的荧光标记
5.3.3 cHSA的制备与标记
5.3.4 硒纳米颗粒(SeNPs)的制备
5.3.5 蛋白质的Maldi-Tof-MS表征
5.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试
5.3.7 SeNPs的透射电子显微镜(TEM)成像表征
5.3.8 功能化修饰蛋白与SeNPs的细胞毒性测试
5.3.9活细胞内线粒体共定位实验
5.3.10 活细胞内ROS水平测试
5.3.11 活细胞内线粒体膜电位变化测试
5.3.12活细胞内ROS抑制实验
5.4 结果与讨论
5.4.1 实验原理
5.4.2 蛋白质HSA的正电荷化修饰与表征
5.4.3 cHSA@SeNPs的表征与胞内测试
5.4.4 蛋白质HSA的功能化修饰与表征
5.4.5 HSA-TPP靶向修饰蛋白的生物相容性探究
5.4.6 SeNPs的制备与表征
5.4.7 靶向基团修饰对SeNPs抗肿瘤效果提升的机理研究
5.5 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 全文总结
6.2 工作展望
致谢
参考文献
附录 攻读博士学位期间已发表与待发表论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]MicroRNA的超灵敏检测研究进展[J]. 王子月,刘萌,张春阳. 高等学校化学学报. 2017(01)
[2]嵌段共聚物调控纳米粒子自组装的研究进展[J]. 马世营,汪蓉. 高分子学报. 2016(08)
[3]DNA折纸术纳米反应器[J]. 贾思思,晁洁,樊春海,柳华杰. 化学进展. 2014(05)
[4]无标记microRNA芯片分析方法的建立与优化[J]. 段德民,惠利省,李丽诗,阎锡蕴,李炯. 生物化学与生物物理进展. 2013(05)
[5]痰标本检测p53基因突变及其在肺癌早期临床诊断中的意义（英文）[J]. 汪斌超,李龙芸,姚连昌,刘丽华,朱元珏. Chinese Medical Journal. 2001(07)
本文编号：3207011
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 无机纳米材料与肿瘤诊断
1.2.1 生物传感器概述
1.2.2 金纳米材料与肿瘤诊断
1.2.3 量子点与肿瘤诊断
1.2.4 纳米金刚石与肿瘤诊断
1.2.5 磁性纳米材料与肿瘤诊断
1.3 核酸纳米材料与肿瘤诊断
1.3.1 核酸纳米材料概述
1.3.2 核酸适配体与肿瘤诊断
1.3.3 核酸引物与肿瘤诊断
1.4 无机纳米材料与肿瘤治疗
1.4.1 金纳米材料与肿瘤治疗
1.4.2 硒纳米材料与肿瘤治疗
1.4.3 硅纳米材料与肿瘤治疗
1.5 核酸纳米材料与肿瘤治疗
1.5.1 DNA折纸结构与肿瘤治疗
1.5.2 核酸枝状大分子(Dendrimer)与肿瘤治疗
1.5.3 基于滚环扩增(RCA)的DNA纳米结构与肿瘤治疗
1.6 选题思路
第二章 检测端粒酶活性的DNA纳米传感器研究
2.1 引言
2.1.1 端粒酶与肿瘤诊断
2.1.2 聚集诱导发光(AIE)分子
2.1.3 本章研究目标
2.2 实验仪器与材料
2.2.1 实验试剂
2.2.2 实验仪器
2.3 实验方法与步骤
2.3.1 端粒酶提取
2.3.2 引物延伸反应
2.3.3 体系荧光测试
2.3.4 酶联免疫吸附(Elisa)测试
2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试
2.3.6 端粒酶延伸反应特异性测试
2.3.7端粒酶活性抑制实验
2.3.8 S1 核酸酶降解实验
2.3.9 细胞内端粒酶水平检测
2.4 结果与讨论
2.4.1 实验原理
2.4.2 AIE效应验证
2.4.3 端粒酶延伸反应条件优化
2.4.4 检测体系背景荧光优化
2.4.5 检测特异性对比
2.4.6 端粒酶提取物荧光响应测试
2.4.7 细胞内端粒酶活性检测
2.5 本章小结
第三章 基于荧光纳米金刚石的生物传感器设计及其应用
3.1 引言
3.1.1 MicroRNA与肿瘤诊断
3.1.2 荧光纳米金刚石概述
3.1.3 本章研究目标
3.2 实验仪器与材料
3.2.1 实验试剂
3.2.2 实验仪器
3.3 实验方法与步骤
3.3.1 双链制备
3.3.2 吸收、荧光光谱测定
3.3.3 FND-C1 的制备
3.3.4 MNP-C2 的制备
3.3.5 生物传感器FND-DNA-MNP的自组装
3.3.6 传感器对靶标miR-21 的响应
3.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测试
3.3.8 动态光散射(DLS)表征颗粒粒径变化
3.3.9 纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)表征
3.3.10 荧光弛豫时间测试
3.4 结果与讨论
3.4.1 实验原理
3.4.2 链置换反应的荧光与凝胶电泳表征
3.4.3 自组装反应优化
3.4.4 FND与 MNP的投料比优化
3.4.5 传感器FND-DNA-MNP的表征
3.4.6 荧光弛豫时间表征
3.4.7 传感器对靶标miR-21 的原位响应表征
3.5 本章小结
第四章 基于DNA折纸技术探究肿瘤细胞靶向因子的最佳分布
4.1 引言
4.1.1 药物载体
4.1.2 转铁蛋白受体
4.1.3 DNA折纸纳米技术
4.1.4 本章研究目标
4.2 实验仪器与材料
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验仪器
4.3 实验方法与步骤
4.3.1 DNA折纸结构制备
4.3.2 DNA折纸结构纯化
4.3.3 生物素的NHS化修饰
4.3.4 转铁蛋白(Tf)的生物素化修饰
4.3.5 DNA折纸结构的转铁蛋白定点修饰
4.3.6 DNA折纸结构的Cy5 荧光基团杂交
4.3.7 琼脂糖凝胶电泳测试
4.3.8 DNA折纸结构的透射电子显微镜(TEM)表征
4.3.9 DNA折纸结构的原子力显微镜(AFM)表征
4.3.10细胞摄取实验
4.4 结果与讨论
4.4.1 实验原理
4.4.2 DNA折纸结构ONR的设计与表征
4.4.3 ONR-Tf结构的表征
4.4.4 ONR结构的Cy5 标记表征
4.4.5 不同ONR结构的细胞摄取效率对比
4.4.6 Tf-TfR识别过程抑制实验
4.5 本章小结
第五章 线粒体靶向无机硒纳米颗粒的抗肿瘤研究
5.1 引言
5.1.1 硒纳米颗粒
5.1.2 ROS与细胞凋亡
5.1.3 本章研究目标
5.2 实验仪器与材料
5.2.1 实验试剂
5.2.2 实验仪器
5.3 实验方法与步骤
5.3.1 HSA蛋白的TPP功能化修饰
5.3.2 HSA与 HSA-TPP的荧光标记
5.3.3 cHSA的制备与标记
5.3.4 硒纳米颗粒(SeNPs)的制备
5.3.5 蛋白质的Maldi-Tof-MS表征
5.3.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试
5.3.7 SeNPs的透射电子显微镜(TEM)成像表征
5.3.8 功能化修饰蛋白与SeNPs的细胞毒性测试
5.3.9活细胞内线粒体共定位实验
5.3.10 活细胞内ROS水平测试
5.3.11 活细胞内线粒体膜电位变化测试
5.3.12活细胞内ROS抑制实验
5.4 结果与讨论
5.4.1 实验原理
5.4.2 蛋白质HSA的正电荷化修饰与表征
5.4.3 cHSA@SeNPs的表征与胞内测试
5.4.4 蛋白质HSA的功能化修饰与表征
5.4.5 HSA-TPP靶向修饰蛋白的生物相容性探究
5.4.6 SeNPs的制备与表征
5.4.7 靶向基团修饰对SeNPs抗肿瘤效果提升的机理研究
5.5 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 全文总结
6.2 工作展望
致谢
参考文献
附录 攻读博士学位期间已发表与待发表论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]MicroRNA的超灵敏检测研究进展[J]. 王子月,刘萌,张春阳. 高等学校化学学报. 2017(01)
[2]嵌段共聚物调控纳米粒子自组装的研究进展[J]. 马世营,汪蓉. 高分子学报. 2016(08)
[3]DNA折纸术纳米反应器[J]. 贾思思,晁洁,樊春海,柳华杰. 化学进展. 2014(05)
[4]无标记microRNA芯片分析方法的建立与优化[J]. 段德民,惠利省,李丽诗,阎锡蕴,李炯. 生物化学与生物物理进展. 2013(05)
[5]痰标本检测p53基因突变及其在肺癌早期临床诊断中的意义（英文）[J]. 汪斌超,李龙芸,姚连昌,刘丽华,朱元珏. Chinese Medical Journal. 2001(07)
本文编号：3207011
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3207011.html
