新型免疫层析法建立及其在心血管疾病检测中的应用研究

发布时间：2021-06-12 00:46

　　心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）是心肌梗死诊断的“金标准”,临床多采用大型免疫分析仪器检测,灵敏度可达到10pg/mL级别,但缺点是对操作人员专业性要求高、仪器购买和维护成本高。侧向免疫层析技术在心肌标志物检测方面已得到广泛应用,具有操作简单、反应快速、仪器便携等优点,但发展受到了灵敏度的制约。研究者通过金染/银染信号放大胶体金光学信号、更高灵敏度的磁信号代替光学信号、引入功能性核酸/蛋白的方法提高检测灵敏度,但又带来其他问题,如背景升高、耗时长、对材料要求高、成本高等。纳米探针的构建方式常常决定层析检测的效果。探针上抗体的数量、取向、免疫活性以及与载体结合的牢固程度则是影响探针功能的关键因素。本文针对这些关键问题,从灵敏、准确、快速、降低成本、易于批量制备等几方面入手,着眼于抗体在微球表面的修饰技术,建立了几种新型荧光定量纳米探针的制备方法,并应用于心肌标志物的检测研究。主要工作如下:1)链霉亲和素-生物素介导的信号放大法。本部分利用微球作为基底,生物素-核心链霉亲和素-生物素-抗体层层结合,最大限度增加了荧光分子和抗体分子在探针上的负载量,可显著提高检测灵敏度和特异性。cTnⅠ最低检出限... 

【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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纳米探针在生物医学中的应用：（a）体内成像[6]

东南大学博士论文4有西安金磁一枝独秀（图1.2b）。尽管量子点法和磁颗粒法市场占有率低，但在当前侧向免疫层析产品同质化严重的大环境下，二者的技术特色和发展潜力值得肯定。图1.2（a）侧向免疫层析厂家省份分布；（b）免疫层析产品类型分布1.2.2.2侧向免疫层析技术的应用近年来，侧向免疫层析技术的应用涵盖了人畜疾病检测、毒品筛查、环境监测、食品安全等诸多领域[25]。其中，应用最广泛、最具研究价值和技术挑战性的当属人类疾病检测。下面介绍几种最具代表性的项目。A）心肌标志物[26，27]心血管疾病包括一系列心脏和血管功能紊乱，是全球人群首位死因。急性发作心血管病人的抢救对时效性的要求远高于其他种类疾病，POCT恰恰能够满足这一需求，因此心血管疾病指标检测是侧向免疫层析发展最快的方向。心肌标志物包括cTnI、肌红蛋白（Myo）等早期诊断标志物，氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）等预后判断标志物等。通过对多种标志物联合检测，可以对病人进行快速分流，及时对症治疗。其中，极低浓度（1-10pg/mL数量级）的cTnI和NT-proBNP对疾病预测、排除、疾病发展预测和预后也具有重要意义，对检测灵敏度提出了更高要求。B）糖尿病我国糖尿病患者和血糖异常人群规模庞大[28]，分别占总人口的1/10和1/2。进行血糖检测能够有效预防和控制糖尿病，血糖仪小型便携，糖尿病患者可以在家庭中自行操作，随时监测自身血糖水平，进行自我健康管理，并为医生后续治疗方案提供依据，已经较为普及[29]。糖化血红蛋白[30]是糖尿病检测另一项重要指

第一章绪论7图1.3（a）试纸条基本结构；（b）试纸条上生物活性物质分布；（c）阳性样本层析过程；（d）阴性样本层析过程1.3纳米探针的构建与信号放大为使侧向免疫层析检测适应当前体外诊断对灵敏度的高要求，研究人员一直致力于优化实验条件，提高层析技术水平，包括不同类型纳米颗粒和信号分子的使用、检测信号二次染色放大、新型纳米探针的构建等。纳米颗粒的类型和相应信号种类已在1.2.2.1小节中介绍，本节重点说明其他几类方案。1.3.1检测信号二次染色放大当待测样本中抗原浓度极低时，检测线捕获的探针太少，信号无法被检测，导致出现假阴性。此时，若将信号成倍放大，强度达到观察者肉眼或检测仪器的分辨率，即可被检测到。胶体金具有模拟酶活性，能够催化金、银离子还原并沉积在其表面，使颗粒粒径增大，并呈更易观察的黑色。利用这一原理，在免疫层析完成后，通过金染或银染，可达到提高灵敏度的目的。隋森芳等[36]首次利用氯金酸和羟胺混合液对固定在NC膜上的胶体金进行原位增强，反复增强一次和两次后，胶体金的粒径分别增加到60nm和200nm，对h-IgG蛋白的检测灵敏度提高到了200pg/mL和10pg/mL，硝酸银和乙酸银染色也不同程度提高了灵敏度（图1.4a～d）。Fu等[37]设计了一种双向进液的卡壳结构，将试纸条固定其中，优化了金染的步骤，使人绒毛膜促性腺激素胎牛血清溶液的最低检出限降低了4


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