TOPK磷酸化ULK1抑制自噬促进胶质瘤对TMZ耐药及机制研究
发布时间：2021-06-26 20:20
背景:胶质瘤是恶性程度最高的脑肿瘤,手术难以全切,对放化疗易产生耐受。自噬异常是胶质瘤对放化疗产生耐受的原因之一,但其调控的机制不明。研究表明,T-淋巴细胞来源的蛋白激酶（TOPK）在胶质瘤干细胞中特异性表达,与胶质瘤放化疗耐受、复发密不可分,但作用机制尚不清楚。目的:1、明确TOPK与自噬的关系。2、阐明TOPK调节自噬的分子机制。3、探索TOPK调控自噬后在胶质瘤对替莫唑胺（TMZ）耐药中的作用。方法:1、收集胶质瘤临床标本和人源性胶质瘤细胞株,Western Blot方法检测自噬活性标志分子（LC3-II和P62）。2、采用沉默或过表达方法降低或增加TOPK表达或采用TOPK特异性抑制剂抑制其活性,Western Blot方法检测自噬活性标志分子（LC3-II和P62）水平;透射电镜实验和荧光实验观察自噬体。3、采用生物信息学技术预测TOPK潜在底物:ULK1是其中之一。4、构建ULK1三个功能域的真核表达质粒,采用Pull down方法确认TOPK与ULK1的相互作用及作用部位。5、采用NetPhos 2.0预测ULK1潜在的磷酸化位点并体外合成相对应肽段。6、体外激酶实验和质...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TOPK、LC3-II和P62在胶质瘤临床标本及人源性胶质瘤细胞中的表达
华中科技大学博士学位论文46表达的Hs683和H4细胞中加入不同浓度梯度的TOPK抑制剂OTS964，MTT方法检测OTS964的毒性作用，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。MTT结果显示，OTS964作用48h对这两株细胞均无毒性的最高浓度是2μM（图1-2A）；WesternBlot结果显示，OTS964处理48h，LC3-II的表达升高，P62的表达下降，且呈剂量依赖性（图1-2B），表明抑制TOPK活性，促进LC3-II表达，抑制P62表达，即抑制TOPK促进自噬。图1-2TOPK抑制剂OTS964诱导Hs683和H4细胞自噬（A）在Hs683和H4细胞中加入OTS964，MTT方法检测OTS964对细胞的毒性。左：Hs683细胞。右：H4细胞。（B）在Hs683和H4细胞中加入OTS964，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。左：Hs683细胞。右：H4细胞。组蛋白H3(Ser10)的磷酸化用来反映TOPK的活性。其次采用shRNA的方法在Hs683和H4细胞中沉默TOPK建立TOPK的沉默稳定细胞系，并选择沉默效果最好的两株细胞，即shTOPK#2和shTOPK#5（图1-3A）进行后续实验。结果显示，与未沉默组细胞相比，TOPK沉默组细胞的LC3-II表达明显升高，P62的表达明显下降（图1-3B），表明沉默TOPK表达，促进LC3-II表达，抑制P62表达，即抑制TOPK促进自噬。
华中科技大学博士学位论文47图1-3沉默TOPK诱导Hs683和H4细胞自噬（A）在Hs683和H4细胞中沉默TOPK，WesternBlot方法检测沉默效果。左：Hs683细胞。右：H4细胞。（B）在Hs683和H4细胞中沉默TOPK，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。左：Hs683细胞。右：H4细胞。最后，通过在TOPK低表达的U118MG细胞中过表达HA-TOPK，建立TOPK过表达的稳定细胞系进一步验证TOPK抑制自噬。结果显示，TOPK过表达细胞中LC3-II的表达低于对照组，而P62的表达高于对照组（图1-4），表明过表达TOPK，抑制LC3-II表达，促进P62表达，即TOPK抑制自噬。图1-4过表达TOPK抑制U118MG细胞自噬综合上述实验结果，我们得出结论：在胶质瘤细胞中，TOPK高表达抑制自噬。3.1.2在胶质瘤细胞中TOPK抑制自噬起始为了进一步明确TOPK抑制自噬的详细机制，作用于自噬过程的哪个阶段？我们采用HBSS激活自噬和氯喹（CQ）阻断自噬体与溶酶体的融合，采用三种实验方法观察自噬流。首先，在Hs683细胞中摸索CQ最适处理条件和HBSS最佳作用时间，图1-5A显示：CQ的最适浓度为50μM，最佳处理时间为3h，HBSS的最佳处理时间为6h。然后，用上述条件处理TOPK沉默的Hs683和H4
本文编号：3252019
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TOPK、LC3-II和P62在胶质瘤临床标本及人源性胶质瘤细胞中的表达
华中科技大学博士学位论文46表达的Hs683和H4细胞中加入不同浓度梯度的TOPK抑制剂OTS964，MTT方法检测OTS964的毒性作用，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。MTT结果显示，OTS964作用48h对这两株细胞均无毒性的最高浓度是2μM（图1-2A）；WesternBlot结果显示，OTS964处理48h，LC3-II的表达升高，P62的表达下降，且呈剂量依赖性（图1-2B），表明抑制TOPK活性，促进LC3-II表达，抑制P62表达，即抑制TOPK促进自噬。图1-2TOPK抑制剂OTS964诱导Hs683和H4细胞自噬（A）在Hs683和H4细胞中加入OTS964，MTT方法检测OTS964对细胞的毒性。左：Hs683细胞。右：H4细胞。（B）在Hs683和H4细胞中加入OTS964，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。左：Hs683细胞。右：H4细胞。组蛋白H3(Ser10)的磷酸化用来反映TOPK的活性。其次采用shRNA的方法在Hs683和H4细胞中沉默TOPK建立TOPK的沉默稳定细胞系，并选择沉默效果最好的两株细胞，即shTOPK#2和shTOPK#5（图1-3A）进行后续实验。结果显示，与未沉默组细胞相比，TOPK沉默组细胞的LC3-II表达明显升高，P62的表达明显下降（图1-3B），表明沉默TOPK表达，促进LC3-II表达，抑制P62表达，即抑制TOPK促进自噬。
华中科技大学博士学位论文47图1-3沉默TOPK诱导Hs683和H4细胞自噬（A）在Hs683和H4细胞中沉默TOPK，WesternBlot方法检测沉默效果。左：Hs683细胞。右：H4细胞。（B）在Hs683和H4细胞中沉默TOPK，WesternBlot方法检测LC3-II和P62。左：Hs683细胞。右：H4细胞。最后，通过在TOPK低表达的U118MG细胞中过表达HA-TOPK，建立TOPK过表达的稳定细胞系进一步验证TOPK抑制自噬。结果显示，TOPK过表达细胞中LC3-II的表达低于对照组，而P62的表达高于对照组（图1-4），表明过表达TOPK，抑制LC3-II表达，促进P62表达，即TOPK抑制自噬。图1-4过表达TOPK抑制U118MG细胞自噬综合上述实验结果，我们得出结论：在胶质瘤细胞中，TOPK高表达抑制自噬。3.1.2在胶质瘤细胞中TOPK抑制自噬起始为了进一步明确TOPK抑制自噬的详细机制，作用于自噬过程的哪个阶段？我们采用HBSS激活自噬和氯喹（CQ）阻断自噬体与溶酶体的融合，采用三种实验方法观察自噬流。首先，在Hs683细胞中摸索CQ最适处理条件和HBSS最佳作用时间，图1-5A显示：CQ的最适浓度为50μM，最佳处理时间为3h，HBSS的最佳处理时间为6h。然后，用上述条件处理TOPK沉默的Hs683和H4
本文编号：3252019
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