HBV调控自身及宿主细胞基因组的表观遗传学机制与方法研究
发布时间：2021-09-01 05:17
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是临床上常见的恶性肿瘤之一,中国肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。在我国,乙型肝炎病毒（HBV）感染是首要原因,并且超过80%肝癌病例是由慢性乙肝感染（慢乙肝）所导致。目前我们对乙肝病毒的致病机制还不完全清楚,慢乙肝以及慢乙肝所致肝癌仍是我国面临的公共卫生挑战。一方面,HBV病毒特异性感染肝细胞,在肝细胞中完成病毒自身复制等生命过程。HBV病毒的共价闭合环状双链DNA（covalent closed circle DNA,ccc DNA）在宿主细胞中会与组蛋白缠绕,形成微小染色质。ccc DNA微小染色质是HBV病毒自身转录复制的模板,但是目前抗HBV药物:核苷类似物（nucleoside analogue,NA）和α-干扰素（interferon-alpha,IFN-α）难以清除或有效抑制ccc DNA微小染色质的转录。目前我们对介导ccc DNA微小染色质的形成、维持和表观调控的分子机制了解有限,对HBV ccc DNA微小染色质表观调控机制的更深入研究十分必要和紧迫。另一方面,HBV病毒基因组也会整合进入宿主...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
核小体组蛋白KMT2s作用机制示意图
2.3.12.2 原核表达质粒引物设计Plasmid constructionHindIII-HA-RHBX-N-RHBX-M-RHBX-C-RHBX-M-α-helix-deletion-REcoRI-HBX-HindIII-FTACAAGCTTTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGACGTCGTATGGGTACCCGTGGTCGGTCGACGTCGTATGGGTAGAGTCCAAGAGTCCTCGACGTCGTATGGGTAGGCAGAGGTGAAAAAGTGACGTCGTATGGGTATTGGTGGGCGTTCAGGTGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCXbaI-WDR5-FXhoI-WDR5-RGAATCTAGAGATGGCGACGGAGGAGAAGAAGGTCCTCGAGTTAGCAGTCACTCTTCCACAGTTTA2.3.12.3 原核表达质粒构建引物设计合成→目的基因 PCR 扩增、酶切/表达载体酶切、纯化→载体与目的片段连→转化感受态细菌→平板克隆→摇菌、质粒纯化、酶切鉴定→阳性克隆测序鉴定→高纯度质粒抽提。
图 2.4.1.1 肝癌中 WDR5 蛋白检测 2.4.1.1 (A) 免疫印迹检测 WDR5 蛋白水平在正常肝细胞、肝癌细胞以及相应癌旁组织中的。用免疫印迹法检测不同组织的蛋白提取物，并用 WDR5 抗体进行检测。采用 GAPDH 作为蛋白。Ca，癌组织；P，肿瘤周组织；N，正常健康组织（n=16）；(B) 肝癌患者肿瘤组织和肿围组织中 WDR5 蛋白的典型 IHC 染色，以及交通事故中肝破裂患者的正常肝组织 WDR5 蛋典型 IHC 染色。2.4.1.2 WDR5 高表达与生存时间呈负相关那么，高表达的 WDR5 蛋白在 HBV 感染的肝癌病人中是否具有广泛性呢？我集了 95 例既往确诊肝细胞癌并且有明确的 HBV 感染临床证据的手术病人标本（包埋保存），通过 IHC 对此 95 例标本进行 WDR5 蛋白水平检测（图 2.4.1.2-A），其表达量高低进行了统计（图 2.4.1.2-B），发现在 95 例肝癌标本中，WDR5 高表1%（39/95），中等表达 32%（30/95），低表达 27%（26/95）。这说明 WDR5 蛋白BV 感染的肝癌标本中普遍高表达。根据 IHC 中 WDR5 蛋白表达高低水平对这 95 人进行生存分析，发现高表达 WDR5 的肝癌病人术后生存时间短于低表达 WDR
本文编号：3376337
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
核小体组蛋白KMT2s作用机制示意图
2.3.12.2 原核表达质粒引物设计Plasmid constructionHindIII-HA-RHBX-N-RHBX-M-RHBX-C-RHBX-M-α-helix-deletion-REcoRI-HBX-HindIII-FTACAAGCTTTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGACGTCGTATGGGTACCCGTGGTCGGTCGACGTCGTATGGGTAGAGTCCAAGAGTCCTCGACGTCGTATGGGTAGGCAGAGGTGAAAAAGTGACGTCGTATGGGTATTGGTGGGCGTTCAGGTGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCXbaI-WDR5-FXhoI-WDR5-RGAATCTAGAGATGGCGACGGAGGAGAAGAAGGTCCTCGAGTTAGCAGTCACTCTTCCACAGTTTA2.3.12.3 原核表达质粒构建引物设计合成→目的基因 PCR 扩增、酶切/表达载体酶切、纯化→载体与目的片段连→转化感受态细菌→平板克隆→摇菌、质粒纯化、酶切鉴定→阳性克隆测序鉴定→高纯度质粒抽提。
图 2.4.1.1 肝癌中 WDR5 蛋白检测 2.4.1.1 (A) 免疫印迹检测 WDR5 蛋白水平在正常肝细胞、肝癌细胞以及相应癌旁组织中的。用免疫印迹法检测不同组织的蛋白提取物，并用 WDR5 抗体进行检测。采用 GAPDH 作为蛋白。Ca，癌组织；P，肿瘤周组织；N，正常健康组织（n=16）；(B) 肝癌患者肿瘤组织和肿围组织中 WDR5 蛋白的典型 IHC 染色，以及交通事故中肝破裂患者的正常肝组织 WDR5 蛋典型 IHC 染色。2.4.1.2 WDR5 高表达与生存时间呈负相关那么，高表达的 WDR5 蛋白在 HBV 感染的肝癌病人中是否具有广泛性呢？我集了 95 例既往确诊肝细胞癌并且有明确的 HBV 感染临床证据的手术病人标本（包埋保存），通过 IHC 对此 95 例标本进行 WDR5 蛋白水平检测（图 2.4.1.2-A），其表达量高低进行了统计（图 2.4.1.2-B），发现在 95 例肝癌标本中，WDR5 高表1%（39/95），中等表达 32%（30/95），低表达 27%（26/95）。这说明 WDR5 蛋白BV 感染的肝癌标本中普遍高表达。根据 IHC 中 WDR5 蛋白表达高低水平对这 95 人进行生存分析，发现高表达 WDR5 的肝癌病人术后生存时间短于低表达 WDR
本文编号：3376337
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