HtrA2/Omi功能异常与帕金森病DA神经元凋亡的分子机制研究

发布时间：2021-11-01 05:13

　　目的:主要探讨PD模型中HtrA2/Omi功能异常与DA神经元凋亡、内质网应激及Wnt信号通路相关性的分子机制,并评估干预HtrA2/Omi、Wnt、GSK3β等分子靶点的神经保护作用。方法:1.采用6羟基多巴胺（6-OHDA）干预PC12细胞,构建PD细胞损伤模型,观察6-OHDA诱导下细胞形态学变化。CCK8法检测细胞活力,筛选最佳造模浓度。免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶（TH）的表达。流式细胞法检测细胞的凋亡率。利用Western Blot免疫印迹（WB）技术检测内质网应激及凋亡相关蛋白α-syn、CHOP、Grp78、active caspase3、XIAP和TH等蛋白水平的改变。siRNA慢病毒转染沉默HtrA2/Omi基因,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测沉默效率。WB法检测细胞内质网应激、凋亡蛋白、Wnt通路蛋白。2.CCK8法筛选Ucf101（HtrA2/Omi的特异抑制剂）的最佳浓度。WB法检测Ucf101对PD模型细胞的内质网应激的影响;采用脑立体定位技术右侧黑质致密部（SNc）和中脑腹侧被盖（VTA）两点注射6-OHDA法,建造PD大鼠模型。分别于术后2周、... 

【文章来源】：新疆医科大学新疆维吾尔自治区

【文章页数】：142 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

不同6-OHDA浓度的细胞形态（×100）

第一部分·结果31CON20μM40μM60μM80μM100μM020406080100celviability(ofcontrol)*****图1-2不同浓度6-OHDA对PC12细胞活性的影响*与对照组相比，P＜0.05Fig.1-2TheviabilityofPC12cellsindifferentconcentrationsof6-OHDA*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05Control3h6h12h24h020406080100****celviability(ofcontrol)图1-360μmol/L6-OHDA作用于PC12细胞不同时间对细胞活性的影响*与对照组相比，P＜0.05Fig.1-3Effectsof60μmol/L6-OHDAoncellviabilityinPC12cellsatdifferenttimes*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05图1-4TH的免疫组织化学染色（×200）*与对照组相比，P＜0.05Fig.1-4immunohistochemistryofTH（×200）*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05

新疆医科大学博士学位论文322.1.46-OHDA促使α-syn增加，ER应激增加，介导DA能神经元损伤6-OHDA诱导细胞损伤模型的建立，利用WesternBlot技术检测α-syn、ERS相关蛋白CHOP和Grp78、TH蛋白水平的改变。6-OHDA诱导的PD细胞模型，α-syn、Bip/Grp78和CHOP表达增加，产生ER应激，PD模型细胞的activecaspase3的表达水平明显增加，XIAP、TH的表达明显下降，提示线粒体的caspase途径也参与了PD模型细胞的凋亡，介导了DA神经元损伤，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），（见图1-5）。图1-56-OHDA-PD模型细胞的内质网应激和凋亡相关蛋白的表达*与对照组相比，P＜0.05Fig.1-5theexpressionofendoplasmicreticulumstressandapoptosis-relatedproteinsin6-6-OHDA-PDmodelcells*comparedwithcontrolgroup，P＜0.05图A：PD细胞模型的ER应激相关蛋白的表达，图B：PD细胞模型的凋亡相关蛋白的表达。2.1.66-OHDA诱导PC12细胞凋亡6-OHDA作用于PC12细胞24小时，细胞活力明显下降，通过AnnexinⅤ-PE/7AAD试剂盒检测模型细胞的凋亡，检测结果为对照组凋亡率为3.72±1.35，模型组的凋亡率为24.66±3.54，差异有统计学意义，#P＜0.05（见图1-6）。

【参考文献】：
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本文编号：3469564