染色质裂解在Cyclophilin A促进紫草素诱导的胶质瘤细胞程序性坏死中的作用

发布时间：2021-11-03 19:11

　　背景:神经胶质瘤是神经系统最常见的原发恶性肿瘤之一,具有较高的发病率。临床上胶质瘤的治疗手段主要是手术治疗辅助放化疗。但经过系统性治疗后,患者的平均生存期大多也不超过一年。这可能是由于胶质瘤细胞具有抗凋亡性,导致其对放化疗不敏感,因此通过诱导胶质瘤细胞发生程序性坏死有望成为一种有效的治疗手段。程序性坏死与细胞凋亡不同,它是一种caspase非依赖性的程序性死亡方式,其机制与凋亡相似,但形态学特征与坏死相似。程序性坏死过程首先激活RIP1,RIP1通过其RIP同型作用基团激活下游信号因子RIP3并与之结合形成“坏死体”,除此之外RIP3还可以通过自磷酸化作用而被激活。在程序性坏死的过程中,通常伴有细胞肿胀、胞膜通透性增强、胞核中DNA的损伤以及细胞能量衰竭。DNA损伤包括DNA单链断裂,碱基不稳定性位点和DNA双链断裂等多种形式,其中DNA双链断裂是DNA损伤中最严重的形式,可以造成染色质的裂解,引起细胞死亡。当DNA复制时受到化学药物、电离辐射或氧化应激作用后会导致DNA损伤,发生DNA双链断裂。程序性坏死在DNA双链断裂中的作用尚不完全清楚。在DNA发生双链断裂时,DNA依懒性蛋白激... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
前言
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
第二章 文献综述
    2.1 神经胶质瘤治疗的现状
        2.1.1 治疗方法总论
        2.1.2 手术治疗
        2.1.3 放射治疗
        2.1.4 化学治疗
        2.1.5 其他治疗方法
    2.2 程序性坏死
    2.3 Cyclophilin A
    2.4 紫草素研究现状
第三章 实验材料与方法
    3.1 实验器材与试剂
        3.1.1 主要的实验器材
        3.1.2 主要的实验试剂
    3.2 细胞系及细胞培养裸鼠饲养
    3.3 实验药物、液体及配置方法
    3.4 细胞复苏、传代及冻存
    3.5 实验技术
        3.5.1 MTT法检测胶质瘤细胞的生存率
        3.5.2 LDH乳酸脱氢酶释放法检测胶质瘤细胞的死亡率
        3.5.3 siRNA干扰细胞中蛋白的表达
        3.5.4 通过JC-1 检测线粒体膜电位(荧光显微镜/流式细胞术)
        3.5.5 胶质瘤细胞内ROS水平及线粒体内过氧化物的检测(荧光显微镜/酶标仪)
        3.5.6 Hoechst染色观察胶质瘤细胞形态学变化
        3.5.7 激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内蛋白水平的变化
        3.5.8 彗星实验(中性)
        3.5.9 琼脂糖凝胶电泳
        3.5.10 Western Blot检测细胞胞浆、线粒体及细胞核中蛋白的变化
        3.5.11 裸鼠皮下植瘤及给药
        3.5.12 统计学分析
第四章 实验结果
    4.1 紫草素能够抑制胶质瘤细胞的活性并且能够诱导胶质瘤细胞的死亡
        4.1.1 MTT法检测紫草素时间梯度胶质瘤细胞的生存率
        4.1.2 LDH法检测紫草素时间梯度胶质瘤细胞的死亡率
    4.2 紫草素能够造成胶质瘤细胞染色质裂解
        4.2.1 激光共聚焦显微镜结合Hoechst 33258 染色观察紫草素作用前后,胶质瘤细胞中细胞核的形态学改变
        4.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳法检测紫草素诱导的胶质瘤细胞DNA的损伤与断裂
    4.3 紫草素能够诱导胶质瘤细胞胞浆、线粒体和胞核中CypA表达的上调
    4.4 抑制CypA可以减少紫草素诱导胶质瘤细胞的死亡和染色质裂解
        4.4.1 LDH检测使用siRNA沉默CypA后,紫草素诱导胶质瘤细胞死亡率的改变
        4.4.2 LDH检测使用CypA特异性抑制剂CsA提前1小时预处理后,紫草素诱导胶质瘤细胞死亡率的改变
        4.4.3 Western Blot检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA提前1小时预处理后,紫草素诱导胶质瘤细胞胞浆、线粒体和胞核中CypA蛋白水平的改变
        4.4.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA后能够明显缓解紫草素诱导胶质瘤细胞染色质裂解
    4.5 紫草素通过CypA诱导胶质瘤细胞发生线粒体损伤和AIF核转位
        4.5.1 荧光显微镜结合JC-1 染色观察紫草素诱导胶质瘤细胞中线粒体的损伤
        4.5.2 流式细胞术结合JC-1 检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA提前1小时预处理后,对紫草素诱导胶质瘤细胞线粒体膜电位改变的影响
        4.5.3 Western Blot检测紫草素处理后胶质瘤细胞胞浆、线粒体和胞核中AIF表达的改变
        4.5.4 激光共聚焦显微镜结合Hoechst 33258 染色观察紫草素作用后AIF核易位
        4.5.5 Western Blot检测siRNA敲低AIF后,紫草素诱导的胶质瘤细胞胞浆和胞核中AIF蛋白水平的变化
        4.5.6 LDH检测siRNA敲低AIF后,紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡率的变化
        4.5.7 DNA琼脂糖凝胶电泳检测使用siRNA沉默AIF后能够明显缓解紫草素诱导胶质瘤细胞染色质裂解
        4.5.8 Western Blot检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA提前1小时预处理后,紫草素诱导胶质瘤细胞胞浆和胞核中AIF蛋白水平的改变
        4.5.9 激光共聚焦显微镜结合Hoechst 33258 和mitotracker染色,观察紫草素作用前后,胶质瘤线粒体和细胞核中CypA的变化
    4.6 紫草素通过CypA诱导胶质瘤细胞DNA发生双链断裂
        4.6.1 Western Blot检测siRNA CypA敲低CypA或CsA提前小时预处理后,紫草素诱导的胶质瘤细胞胞核中 γ-H2AX、p-ATM和p-DNAPKcs蛋白水平的变化
        4.6.2 激光共聚焦显微镜结合Hoechst 33258 染色观察紫草素作用前后,胶质瘤细胞核中 γ-H2AX的变化
        4.6.3 中性彗星实验观察紫草素诱导胶质瘤细胞DNA损伤与DNA双链断裂
    4.7 CypA通过引起线粒体超氧化物的过量产生来提高细胞中ROS水平
        4.7.1 荧光显微镜结合Mitosox染色观察紫草素对胶质瘤细胞线粒体内超氧化物含量的影响
        4.7.2 荧光显微镜结合DCFH-DA染色观察紫草素对胶质瘤细胞中ROS含量的影响
        4.7.3 Mitosox检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA提前1小时预处理后,对紫草素诱导胶质瘤细胞线粒体内超氧化物产生的影响
        4.7.4 DCFH-DA检测使用siRNA沉默CypA或使用CypA特异型抑制剂CsA提前1小时预处理后,对紫草素诱导胶质瘤细胞中ROS产生的影响
        4.7.5 Mitosox染色检测CsA和线粒体超氧化物特异性抑制剂MnTBAP对紫草素诱导胶质瘤细胞线粒体中超氧化物产生的影响
        4.7.6 DCFH-DA染色检测CsA和MnTBAP对紫草素诱导胶质瘤细胞中ROS产生的影响
    4.8 RIP1和RIP3能够上调胶质瘤细胞胞浆、线粒体和胞核中CypA的蛋白水平
        4.8.1 Western Blot检测siRNA敲低RIP1和RIP3时,紫草素诱导的胶质瘤细胞中CypA蛋白水平的变化
        4.8.2 Western Blot检测使用抑制剂Nec-1 或GSK872抑制RIP1或RIP3时,紫草素诱导的胶质瘤细胞中CypA蛋白水平的变化
    4.9 紫草素在体内诱导胶质瘤细胞中CypA活化和染色质的裂解
第五章 讨论
第六章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]成人脑恶性胶质瘤术后两种同步放化疗方案的疗效比较[J]. 翟小明,王建平,张军宁,顾科.  南方医科大学学报. 2012(02)
[2]三维适形放射治疗联合替莫唑胺治疗脑胶质瘤的疗效及安全性[J]. 王龙云,涂青松,周卫兵,周蓉蓉.  中南大学学报(医学版). 2011(11)



本文编号：3474195