两种单克隆抗体的LC-MS/MS定量生物分析及其药动学研究
发布时间：2022-01-27 01:58
近年来单克隆抗体药物发展迅速,已成为全球新药开发的热点。单抗在临床上主要用于肿瘤、自身免疫性疾病及炎症疾病的治疗。单抗的分子量、体积和极性都远大于小分子,使得单抗与小分子药物在药代动力学特征上具有非常大的差异。肠外给药、分布容积小、消除半衰期长是单抗最显著的临床药代动力学特征。一直以来,蛋白类药物生物分析的首选方法是配体结合分析（LBA）,但由于LBA的局限性,近年有研究者提出了LC-MS/MS的补充/替代分析策略。本课题分别建立了LC-MS/MS法对血清中的两种单抗（SHR-1603和SHR-1222）进行定量检测,经验证的LC-MS/MS方法都分别应用于两种药物的临床前研究,并与两种单抗药物的电化学发光法（MSD-ECL,基于LBA的分析方法）进行比较。1.电化学发光法测定食蟹猴和大鼠血清中SHR-1603SHR-1603是由江苏恒瑞医药股份有限公司研发的全人源化单抗,作用靶点为CD47,目前处于临床I期,临床拟用于肿瘤治疗。首先建立了MSD-ECL法分别检测食蟹猴和大鼠血清中的SHR-1603。该方法的定量范围为19.510000ng/mL,允许血清样品进行...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
抗体的结构与分类Figure1-1Structureandclassificationofantibodies
LC-MS/MS法检测血清中的单克隆抗体SHR-1603和SHR-122212前试验中也观察到了类似的效果[138]。图1-2抗CD47抗体阻断“别吃我”通路，引发吞噬作用（图片来源于网络）Figure1-2TheroleofCD47incancerandthemechanismofanti-CD47monoclonalantibodiesincancertreatment.本研究中的药物SHR-1603是由江苏恒瑞医药股份有限公司研发，靶向CD47的抗体药物，具有IgG4结构，目前处于临床I期的研究阶段，拟用于肿瘤治疗。目前还未有关于SHR-1603生物分析的文献报告。本研究将采用食蟹猴和SD大鼠考察SHR-1603注射液的药代动力学，揭示其在食蟹猴和SD大鼠体内的处置规律，为SHR-1603注射液后续的临床试验方案设计提供试验依据。1.4.2硬骨素与SHR-1222骨质疏松（osteoporosis）是由多种原因引起的一种以单位体积内骨组织量减少为特点的骨代谢性疾病，以骨丢失、微结构恶化和骨强度受损为特征，常表现为骨骼疼痛、易于骨折等[139,140]，常发于绝经后妇女中[141-143]。在脆性骨折中，脊椎和髋部骨折的发病率和死亡率最高[144,145]。随着人口老龄化，骨质疏松的发病率呈逐年上升趋势，由此所带来的社会经济负担大幅增加，须引起人们的警惕[146]。骨重建是骨形成和骨吸收相互作用的动态过程，为了维持骨的动态平衡，骨形成和骨吸收必须保持动态平衡。在这个过程中，成骨细胞的作用是引导骨形成，而破骨细胞则引导骨吸收[147]。治疗骨质疏松的传统方式主要有：服用抑制骨吸收的药物，如钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐（阿仑膦酸钠）、雌激素以及异黄酮；促进骨形成的药物，如氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。但是传统药物只能应症，不能使患者的骨重建过程恢复平衡。
第3章两种LC-MS/MS法测定食蟹猴和大鼠血清中的SHR-160329图3-1两种LC-MS/MS法和MSD-ECL法的实验流程Figure3-1workflowoftwoLC-MS/MSmethodsandMSD-ECLmethodStraightLC-MS/MS法2.00μL血清样品加到96聚丙烯孔板中，加入9倍体积含0.1%SDS的PBS溶液，充分混合，将样品稀释10倍（实际操作中，为避免操作误差，可以按比例放大体积进行10倍稀释，但只取20.0μL加入聚丙烯96孔板中）。加入20.0μLDTT（100mmol/L），放入恒温振荡器中60°C、300rpm下反应30min。冷却至常温后加入20μL的IAA（250mmol/L），在避光条件下室温反应15min。然后在混合物中加入180μL的冰甲醇进行蛋白沉淀，1000rpm震荡10min，4°C离心10min。小心地除去上清液，将蛋白沉淀留在孔板底部。向孔板中的蛋白沉淀（pellet）相继加入80μL碳酸氢铵缓冲液（50mmol/L，pH=8.0），内标溶液20μL（250ng/mL），10μL胰蛋白酶（100ug/mL）和10μLBSAdigest（20×）。将此混合物体系放入恒温震荡器，在60°C、1400rpm的条件下孵育1.5小时。将孔板拿出冷却至室温，加入30μL终止液（含1%TFA的60%ACN），常温下1000rpm震荡10min以终止酶切。该体系充分混匀之后，放入自动进样器等待进行检测，进样量10.0μL。IA-LC-MS/MS法与straightLC-MS/MS法不同的是，该法对样品进行了预先纯化富集。具体实验步骤如下：
本文编号：3611536
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
抗体的结构与分类Figure1-1Structureandclassificationofantibodies
LC-MS/MS法检测血清中的单克隆抗体SHR-1603和SHR-122212前试验中也观察到了类似的效果[138]。图1-2抗CD47抗体阻断“别吃我”通路，引发吞噬作用（图片来源于网络）Figure1-2TheroleofCD47incancerandthemechanismofanti-CD47monoclonalantibodiesincancertreatment.本研究中的药物SHR-1603是由江苏恒瑞医药股份有限公司研发，靶向CD47的抗体药物，具有IgG4结构，目前处于临床I期的研究阶段，拟用于肿瘤治疗。目前还未有关于SHR-1603生物分析的文献报告。本研究将采用食蟹猴和SD大鼠考察SHR-1603注射液的药代动力学，揭示其在食蟹猴和SD大鼠体内的处置规律，为SHR-1603注射液后续的临床试验方案设计提供试验依据。1.4.2硬骨素与SHR-1222骨质疏松（osteoporosis）是由多种原因引起的一种以单位体积内骨组织量减少为特点的骨代谢性疾病，以骨丢失、微结构恶化和骨强度受损为特征，常表现为骨骼疼痛、易于骨折等[139,140]，常发于绝经后妇女中[141-143]。在脆性骨折中，脊椎和髋部骨折的发病率和死亡率最高[144,145]。随着人口老龄化，骨质疏松的发病率呈逐年上升趋势，由此所带来的社会经济负担大幅增加，须引起人们的警惕[146]。骨重建是骨形成和骨吸收相互作用的动态过程，为了维持骨的动态平衡，骨形成和骨吸收必须保持动态平衡。在这个过程中，成骨细胞的作用是引导骨形成，而破骨细胞则引导骨吸收[147]。治疗骨质疏松的传统方式主要有：服用抑制骨吸收的药物，如钙剂、维生素D及活性维生素D、降钙素、二磷酸盐（阿仑膦酸钠）、雌激素以及异黄酮；促进骨形成的药物，如氟化物、合成类固醇、甲状旁腺激素以及异黄酮。但是传统药物只能应症，不能使患者的骨重建过程恢复平衡。
第3章两种LC-MS/MS法测定食蟹猴和大鼠血清中的SHR-160329图3-1两种LC-MS/MS法和MSD-ECL法的实验流程Figure3-1workflowoftwoLC-MS/MSmethodsandMSD-ECLmethodStraightLC-MS/MS法2.00μL血清样品加到96聚丙烯孔板中，加入9倍体积含0.1%SDS的PBS溶液，充分混合，将样品稀释10倍（实际操作中，为避免操作误差，可以按比例放大体积进行10倍稀释，但只取20.0μL加入聚丙烯96孔板中）。加入20.0μLDTT（100mmol/L），放入恒温振荡器中60°C、300rpm下反应30min。冷却至常温后加入20μL的IAA（250mmol/L），在避光条件下室温反应15min。然后在混合物中加入180μL的冰甲醇进行蛋白沉淀，1000rpm震荡10min，4°C离心10min。小心地除去上清液，将蛋白沉淀留在孔板底部。向孔板中的蛋白沉淀（pellet）相继加入80μL碳酸氢铵缓冲液（50mmol/L，pH=8.0），内标溶液20μL（250ng/mL），10μL胰蛋白酶（100ug/mL）和10μLBSAdigest（20×）。将此混合物体系放入恒温震荡器，在60°C、1400rpm的条件下孵育1.5小时。将孔板拿出冷却至室温，加入30μL终止液（含1%TFA的60%ACN），常温下1000rpm震荡10min以终止酶切。该体系充分混匀之后，放入自动进样器等待进行检测，进样量10.0μL。IA-LC-MS/MS法与straightLC-MS/MS法不同的是，该法对样品进行了预先纯化富集。具体实验步骤如下：
本文编号：3611536
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