唐氏综合征产前筛查母体血液生物新标志物筛选及检测方法的建立

发布时间：2017-05-15 23:01

  本文关键词：唐氏综合征产前筛查母体血液生物新标志物筛选及检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：唐氏综合征(Down's syndrome,DS)是由21号染色体异常而引起的一种常见体智发育缺陷性遗传病,患者多表现为肢体和器官发育畸形,并常伴有明显的智力缺陷。目前DS在人群中的发病率约为0.1~0.2%,且随着工作压力和妇女妊娠年龄的增加,及辅助生育技术的广泛应用,其发病率还有进一步升高的趋势。目前,DS作为一种先天遗传性疾病,尚缺乏可靠治愈方法,DS患儿的出生将会给患者及其家庭、社会带来较大的痛苦和负担。因此,为了尽早准确诊断DS妊娠,减少患儿出生,多种产前筛查和产前诊断技术被广泛应用于DS妊娠早中期的产前诊断。通过羊膜穿刺和绒膜取样等技术取材,对胎儿脱落细胞的染色体检查可准确鉴别DS患儿,是当前DS产前诊断的金标准,但有创穿刺技术可导致1%左右的流产风险,不宜在孕妇中广泛推广。临床最常用的手段是先在妊娠早中期利用母体血清标志物进行产前筛查,DS妊娠高风险孕妇再进行染色体检查。常用的DS产前筛查方法是将孕妇年龄、母体血清标志物、胎儿超声标志物等检测指标整合成多种筛查方案,进而在孕早期或中期进行DS妊娠高危风险的筛查评估。目前,临床最常用的筛查组合是血清生化标志物联合筛查方案以及血清生化标志物筛查结合超声检查指标方案。本研究首先采用Meta分析方法,对甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、非结合雌三醇(unconjugated estriol,uE3)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)组成的母体血清三联筛查(serum triple screening test,STS)模式和血清生化筛查指标与胎儿颈项部半透明层厚度(ultrasonographic nuchal translucency,NT)超声检测指标组成的整合式筛查(integrated screening test,INS)模式进行了系统的评估与比较。而后在前期DS妊娠母体血清比较蛋白组学研究和DS产前筛查常用血清生化标志物方法进行Meta分析基础上,从系统生物学角度出发,对DS孕妇血液进行整体代谢组学和microRNA组学研究,并基于Western blot技术对前期获得的多种唐氏妊娠相关母体血清蛋白质新标志物进行验证,建立了三种蛋白标志物的时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)方法,本研究结果有望为唐氏综合征的无创产前筛查提供母体血液潜在新标志物和筛查检测新方法。目的1.评估sts和ins两种组合筛查方案在ds妊娠产前筛查中的检测性能;2.建立ds妊娠母体血清代谢组学诊断模型,筛选ds妊娠相关的潜在母体血清代谢标志物,探讨ds疾病发生发展可能涉及的生化代谢通路;3.筛选ds妊娠相关的潜在母体血浆microrna标志物,探讨与疾病发生可能相关的基因表达调控情况;4.对前期筛选获得的ds妊娠相关的母体血清dgtpase、β2-糖蛋白i(beta2-glycoproteini,β2-gpi)、补体因子h相关蛋白1前体(complementfactorh-relatedprotein1precursor,cfhr1)和激肽原1亚基2(kininogen1isoform2,kng1)等4种蛋白标志物进行验证,并建立相应的trfia检测方法。方法1.利用pubmed,isisciencecitationindex和embase三大外文数据库,以及中国生物医学文献服务系统、中国知识基础设施工程、维普期刊资源整合服务平台等三大中文数据库,系统搜索与sts和ins两种常用唐氏产前筛查方案相关的各种文献资料,参考cochranelibrary协作网的诊断性实验研究中关于meta分析的文献筛选标准,确定本研究的纳入和排除标准,筛选出所有符合要求的出版文献。采用诊断性研究的文献质量评分(quadas-2)标准对纳入文献进行质量评价,提取各篇文献的作者姓名、出版时间、国家或地区、样本的来源和种类、样本例数、唐氏筛查组合模式、风险阈值,quadas-2评分等相关数据资料。整合数据采用meta-disc(1.4版本)和revman(5.2版本)软件进行分析,通过summaryreceiveroperatingcharacteristic(sroc)曲线图比较两种ds产前筛查方案的诊断性能差异。2.采用液相色谱-串联质谱联用技术(liquidchromatography-tandemmassspectrometry,lc-ms/ms)和气相色谱与质谱技术(gaschromatography-massspectroscopy,gc-ms)整合检测血清代谢物组份,所得数据通过主成分分析(principalcomponentanalysis,pca)、聚类分析和随机森林图分析(randomforestanalysis,rf)等生物信息学处理,建立ds妊娠母体血清代谢物组学诊断模型。以p0.05且差异倍数在1倍以上作为具有统计学差异的判断标准,采用welcht检验对筛选所得具有显著差异的代谢化合物进行统计学分析,探讨与唐氏综合征可能相关的代谢途径及相应代谢化合物。3.采用trizolls试剂提取血浆总rna,纯化样本并定量rna浓度后,进行rna标记和基因芯片杂交。杂交芯片经扫描仪扫描,采集扫描数据并标准化处理,采用genepixprov6.0芯片分析软件获取ds妊娠和正常妊娠母体血浆microrna分子杂交实验数据。并对相应结果进行聚类分析和火山图分析,以p0.05且差异倍数在2倍以上作为具有统计学差异的标准,采用非配对t检验对表达差异显著的microrna进行筛选和鉴定,获得唐氏妊娠母体血浆中异常表达的microrna分子。4.采用westernblot方法对前期血清蛋白组学技术筛选获得的dgtpase、β2-gpi、cfhr1、kng1四种蛋白标志物在ds妊娠母体血清中的表达水平进行验证;同时,基于trfia技术构建dgtpase、β2-gpi和kng1三种蛋白质标志物的免疫学检测方法,并对新建的检测方法进行方法学评价;通过临床标本检测,初步建立三种血清蛋白标志物在正常孕妇血清中的参考值和唐氏孕妇中的阳性区间。结果1.sts和ins对ds产前筛查性能的meta分析①系统检索数据库共获得文献499篇,经严格筛选与鉴别,最终共计18篇文献被纳入本次meta分析研究,涉及样本183,998例。其中应用于sts和ins分析的文献分别为13篇和6篇。②meta-disc软件分析显示,sts检测的合并敏感性为0.77(95%ci=0.73~0.81),合并特异性为0.94(95%ci=0.94~0.94),阳性似然比(positivelikelihoodratio,plr)、阴性似然比(negativelikelihoodratio,nlr)分别为9.78(95%ci=6.87~13.93)和0.26(95%ci=0.22~0.31),合并诊断比值比(diagnosticoddsratio,dor)为44.72(95%ci=30.77~65.01),sroc曲线图的曲线下面积(theareaunderthecurve,auc)和q值分别为0.9064和0.8381。ins筛查的合并敏感性为0.93(95%ci=0.90~0.95),合并特异性为0.93(95%ci=0.93~0.93),plr和nlr分别为22.38(95%ci=12.47~40.14)和0.08(95%ci=0.05~0.11),合并dor值为289.81(95%ci=169.08~496.76),sroc曲线图的auc和q值分别为0.9781和0.9337。③将sts和ins两种筛查方案的sroc曲线整合于同一张图上,结果显示ins曲线明显高于sts;二者z检验中auc比较的z统计量=3.957,p0.01,q值的z统计量=4.613,p0.01,提示ins在ds妊娠产前筛查方面的敏感性、plr、nlr和dor指标均明显优于sts。2.ds妊娠母体血清代谢组学诊断模型的建立和特异代谢标志物的筛选①正常孕妇(up组)和ds孕妇(dp组)质谱分析数据经pca处理,结果显示,对区分两组贡献最大的三种主成分comp1、comp2、comp3的贡献比率分别为34.86%,10.46%和5.99%,三者之和为51.31%,显著大于40%的判断阈值,提示pca模型可将up和dp两组标本明显区分开,模型构建比较稳定。②两组质谱分析数据的聚类分析图显示,up组标本大多聚集在左侧区域,dp组标本大多聚集在中间偏右侧区域,所得聚类分析模型可将up、dp两组标本区分开。③两组质谱分析数据的rf分析结果显示,对组间分类贡献靠前的代谢物主要有碳水化合物类、氨基酸类、血红素代谢类、能量代谢类、脂质代谢类和核苷酸代谢类等,该rf图对两组的预测准确性高达97%,组间分辨能力较强。④两组质谱分析数据采用t检验统计分析,dp组共获得193种差异显著的母体血清代谢产物,其中含量升高的有16种,含量降低的有177种,它们分别涉及能量代谢通路、脂类代谢通路、氨基酸与多肽代谢通路、核苷酸代谢通路、血红素代谢通路等多种代谢途径。3.ds妊娠母体血浆microrna标志物的初步筛选①up和dp两组血浆microrna杂交芯片扫描图片显示,各基因杂交位点清晰,无漏点、基因点位重叠现象或异常荧光出现,基因点位的背景图像清楚、色泽均匀,提示microrna芯片杂交结果可靠,满足实验要求。②up和dp两组所获microrna数据的聚类分析结果显示,up组标本均聚集于横坐标左侧,dp组则聚集于横坐标右侧,各组内部6例标本的含量相对较一致,区分度良好。③up和dp两组所获microrna数据经火山图和非配对t检验分析,在ds妊娠母体血浆中共筛选获得135条表达差异显著的microrna分子,其中表达显著性升高的95条,表达显著性降低的40条。4.ds妊娠母体血清新蛋白标志物的验证及相关检测方法的建立①westernblot结果显示:与up组相比,dp组血清中的dgtpase、cfhr1和kng1的含量显著升高(p0.01或p0.05),而β2-gpi的水平则显著降低(p0.01),与前期蛋白组学研究结果一致,提示上述蛋白质标志物有望用于ds产前筛查。②在dgtpase、β2-gpi和kng1的trfia检测方法中,鼠源性包被一抗最适浓度分别为25μg/ml、10μg/ml和25μg/ml,兔源性游离二抗最适浓度分别为10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml,eu3+标记抗兔检测抗体的最适浓度分别为10μg/ml、5μg/ml和5μg/ml。dgtpase标准曲线方程式为:lg(y)=0.867lg(x)+lg1789,决定系数r2=0.992,β2-gpi标准曲线方程式为:lg(y)=1.009lg(x)+lg1164,决定系数r2=0.991,kng1标准曲线方程式为:lg(y)=0.982lg(x)+lg1579,决定系数r2=0.984。③dgtpase、cfhr1和kng1蛋白标志物trfia检测方法的评价:dgtpase的trfia检测方法最低检测线为3.06ng/ml,批内、批间的变异系数分别介于2.4~4.8%和6.8~10.3%之间,回收率介于96.9~102.8%,与常见血清蛋白的交叉反应率介于0.12~1.02%。β2-gpi的trfia检测方法最低检测线为3.91ng/ml,批内、批间的变异系数分别介于3.5~5.0%和6.8~9.2%之间;回收率介于96.1~105.9%,与常见血清蛋白的交叉反应率介于0.11~0.91%之间,与abcam公司检测试剂盒的相关性曲线方程式为y=1.005x+0.039,决定系数r2=0.996,p0.01。kng1的trfia检测方法最低检测线为2.16ng/ml,批内、批间的变异系数分别介于3.5~5.5%和5.3~10.2%之间,回收率介于93.4~107.0%,与常见血清蛋白的交叉反应率也是介于0.08~1.20%之间,与abcam公司检测试剂盒相关性曲线为y=0.993x+22.67,决定系数r2=0.994,p0.01。④dgtpase、β2-gpi和kng1三种蛋白在up组、常规筛查高危组和dp组中的浓度:dgtpase浓度分别为:40.9±1.7μg/ml、43.2±2.6μg/ml和95.6±4.4μg/ml,β2-gpi浓度分别为:215.9±13.6μg/ml、203.4±11.1μg/ml和103.8±1.4μg/ml,kng1浓度分别为84.3±1.3μg/ml、98.2±4.8μg/ml和231.9±8.2μg/ml。三种蛋白标志物含量在up和dp组之间、常规筛查高危组和dp组之间均有显著差异(p0.01),在up组和常规筛查高危组之间无显著差异(p0.05)。结论1.ins在唐氏筛查方面的诊断性能显著优于sts,但两种筛查方案均存在较高的假阳性率。因此,有必要探索具有更高特异性和诊断效能的母体血液生物新标志物,以提高ds产前筛查实验的诊断性能。2.成功建立了ds妊娠母体血清代谢组学诊断模型,筛选获得一组含量差异显著的代谢组学化合物,为ds妊娠中期产前筛查潜在母体代谢标志物筛选提供了新线索。3.ds妊娠或ds的发病机制可能涉及氨基酸类、血红素代谢类、碳水化合物类、能量代谢类、脂质代谢类和核苷酸代谢类等多种生化代谢通路的异常。4.筛选获得一组ds妊娠特异相关的microrna分子,有望为ds妊娠中期产前筛查提供潜在的microrna标志物。5.ds妊娠或ds的发生发展过程中可能存在部分基因表达调控异常,为ds发病机制中基因表达异常的探讨提供了新思路。6.dGTPase、CFHR1、β2-GPI和KNG1四种血清蛋白质可能是DS产前筛查潜在的蛋白标志物。7.创建了dGTPase、β2-GPI和KNG1等三种潜在蛋白标志物的TRFIA检测方法,初步建立了三种蛋白在正常妊娠和DS妊娠母体血清中的浓度参考范围,有望为唐氏综合征无创产前筛查提供母体血液潜在蛋白新标志物和检测新方法。
【关键词】：唐氏综合征 生物标志物 代谢组学 MicroRNA 时间分辨荧光免疫分析
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.5;R446.6
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-18
• 第一章 前言18-21
• 第二章 STS和INS在DS产前筛查中诊断性能的Meta分析21-37
• 2.1 材料和方法21-24
• 2.2 结果24-32
• 2.3 讨论32-36
• 2.4 小结36-37
• 第三章 DS妊娠母体血清代谢组学研究37-55
• 3.1 材料和方法37-39
• 3.2 结果39-49
• 3.3 讨论49-54
• 3.4 小结54-55
• 第四章 DS妊娠母体血浆microRNA标志物的初步筛选55-72
• 4.1 材料和方法55-58
• 4.2 结果58-68
• 4.3 讨论68-71
• 4.4 小结71-72
• 第五章 DS妊娠母体血清蛋白新标志物验证及时间分辨荧光免疫检测方法建立 . 695.1 材料和方法72-99
• 5.1 材料和方法72-79
• 5.2 结果79-93
• 5.3 讨论93-97
• 5.4 小结97-99
• 全文结论99-100
• 参考文献100-108
• 文献综述DS妊娠早期产前筛查研究进展108-121
• 参考文献119-121
• 攻读博士学位期间的研究成果121-122
• 致谢122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Metabolomics:a novel approach to identify potential diagnostic biomarkers and pathogenesis in Alzheimer's disease[J];Neuroscience Bulletin;2012年05期

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本文编号：369063