抗癌蛋白AC-01对大肠癌细胞的影响及其机制研究

发布时间：2017-05-16 00:19

  本文关键词：抗癌蛋白AC-01对大肠癌细胞的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景进入21世纪以来,我国城乡居民的生活水平大幅度提高,大肠癌也逐渐出现了城市化、年轻化的特点,与国外大肠癌发病平均年龄相比,中国的平均发病年龄要低10岁,比21世纪前的发病年龄大幅度提前。因此对于我国医疗界提出了巨大的挑战,寻求更有效的预防和治疗方法迫在眉睫。但是结肠癌的发生发展具备多基因、多步骤、多阶段的特点。手术治疗作为目前首选的治疗方法,在大肠癌治疗策略中的地位异常重要,但囿于手术技术及手术器械改良困难；而化学治疗、放射治疗部分弥补了手术治疗的不足,但其严重的化疗副反应及过强的放疗副损伤却限制了其在临床中的应用。而目前新兴的基因治疗却由于肿瘤细胞生物学的异型性及基因遗传的不稳定性,决定了从基因方面研究及治疗具体肿瘤,也将会是一项异常艰巨的任务。但是,这毕竟是肿瘤治疗领域中的里程碑式的进展,医疗工作者正不畏艰辛,努力挑战。研制新的抗肿瘤药物及其对肿瘤基因的影响机制,这是摆在科研工作者面前的重要研究课题。抗癌蛋白(anticancer protein)是随着近年来肿瘤研究的不断进展,以及基于免疫和分子生物学的飞速发展,被新近提出的一类肿瘤治疗物质总称,也是一种新兴的肿瘤治疗策略,已成为目前肿瘤治疗中的一个新热点。抗肿瘤蛋白特点为分子质量小,极易穿透瘤细胞,具有较强的稳定性,可以通过提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成、直接诱导肿瘤细胞凋亡或阻滞肿瘤细胞周期等作用方式抑制肿瘤的生长和转移。本课题组通过前期实验研究发现了一个人类功能未知的新基因,其对结肠癌细胞系LoVo细胞存在有丝分裂抑制作用,其编码蛋白与未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)存在一定相关性,故将其命名为AC-01,并申请了国家自然基金资助,本实验即为该国家自然科学基金(81172383)课题《AC-01：一种新的抗癌蛋白,生物治疗大肠癌及其URP和信号转导机制的研究》.(2012/01至2015/12.)的分课题之一。但是,根据目前已取得的研究成果,AC-01蛋白对大肠癌的作用机制仍未明确,结合硕士期间成果及大量文献,考虑其可能通过抑制人大肠癌细胞内质网应激,激活其下游信号的传递及相关基因的表达,从而促进肿瘤的凋亡,抑制肿瘤的生长。在哺乳动物细胞内,脂类、糖类及蛋白质合成及修饰的进行需要一个重要场所,这个场所就叫内质网(endoplasmic reticulum, ER)。内质网是一个相对比较敏感的膜性细胞器,它可以调节细胞内钙的贮存与释放,从而起到调节细胞内的钙离子浓度的功能。当各种因素(生理性或病理性)诱发细胞内内质网稳态失衡,使细胞内钙离子浓度改变,以及内质网腔内未折叠/错误折叠蛋白增加,最终产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。ERS进而激活细胞内未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)。UPR主要的表现是新生蛋白的合成减少、未折叠蛋白的降解及折叠增加,进而造成内质网压力减轻,使得内质网稳态得到恢复。但有时内质网应激过于强烈或持久而不能通过减少新生蛋白合成使得其稳态恢复时,UPR还可启动凋亡途径：激活细胞内凋亡信号直接将内质网不能恢复的细胞“处死”。细胞凋亡通路可以分为外源性途径及内源性途径,其中外源性途径指活化细胞内凋亡受体,内源性指损伤细胞内线粒体。近年研究显示,后者(通过内质网应激—UPR--细胞凋亡)是多种疾病发病的重要机制。UPR信号的接收并传递需要跨膜感应蛋白的参与,主要有3个,分别是蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、活化转录因子-6(activating transcription factors-6, ATF-6)、肌醇酶1(inositol requiring enzyme-1,IRE-1)。当内质网没有被激活或保持稳态时,葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78, GRP78)结合在PERK、ATF-6的L端,跨膜感应蛋白处于无活性状态；当内质网被激活而处于应激状态时,内质网腔内未折叠/错误折叠蛋白增加,与ATF-6、PERK的L端解离,跨膜感应蛋白(ATF-6、 PERK)被激活,同时GRP78与未折叠蛋白质结合,直接激活IRE-1。于是跨膜感应蛋白通路被激活,产生UPR:ATF-6、PERK、IRE-1分别激活其相应的下游信号传导通路及相关基因的表达,诱导细胞凋亡。最近研究表明,PERK通路的相关信号因子包括ATF-4、GADD34及CHOP等,它们的激活在细胞凋亡的过程中起到了重要作用。同样地,当内质网应激不强烈时,PERK通路的主要机制是直接抑制蛋白合成,降低内质网压力,从而促使内质网稳态恢复。PERK通路还可间接的通过促进e1F-2α磷酸化来达到抑制蛋白质合成的作用。以上通路还可以通过STAT3信号通路介导细胞凋亡,调控cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表达。从而调节大肠癌细胞的血管形成及凋亡。Stat3是转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcdption, STAT)的重要成员,目前定义为癌基因。STAT3信号传导通路与肿瘤细胞的生物化学特性(增殖、分化及凋亡)密切相关,该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化。本人硕士课题研究《STAT3短发夹RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和侵袭的实验研究》中,利用RNAi特异性沉默结肠癌HCT116细胞中STAT3,进而观察在RNA干扰结肠癌HCT116细胞中的STAT3基因后,结肠癌细胞生长、增殖及凋亡的变化；最终证实通过RNAi技术抑制STAT3mRNA的表达,有效地抑制癌细胞增殖,使结肠癌细胞阻滞于GO.G1期并诱导其凋亡,同时肿瘤细胞侵袭能力明显降低。因此,我们推测AC-01蛋白通过调节大肠癌细胞内质网的应激,调控UPR信号通路,进而影响癌细胞的存活、肿瘤演进、血管形成及凋亡,进而抑制肿瘤的发生及发展。本实验期望通过体内和体外实验,深入探讨抗癌蛋白AC-01对大肠肿瘤细胞生物学特性所产生的影响,以及产生该影响的生物机制,为AC-01应用于大肠癌的生物治疗提供实验证据。第一部分 人大肠癌细胞中AC-01的表达及其与STAT3的关系目的临床收集人大肠癌标本,研究AC-01在大肠癌中的表达及作用。方法在前期研究基础提示STAT3为促癌基因的基础上,首先利用前期所制备的多克隆抗体,首先对该蛋白在大肠组织内的表达特征进行了观察,免疫组化技术检测AC-01在大肠组织中的分布及表达。临床收集人大肠癌组织标本,标本分为八组,每组分肿瘤与癌旁组织,应用Western blot法检测八组中AC-01及STAT3、 pSTAT3的蛋白表达并进行比较。结果免疫组化技术检测AC-01在大肠组织中的分布及表达,结果提示AC-01蛋白在人的正常大肠组织存在表达。人大肠癌组织标本中,肿瘤组织中AC-01蛋白表达低于癌旁组织。Western blot法检测分析结果表明,各组的肿瘤组织的AC-01蛋白表达低于癌旁组织,肿瘤组织组与癌旁组织组相比AC-01蛋白表达降低有显著性差异(Z=-2.521,P=0.012)；肿瘤组织的STAT3蛋白表达高于癌旁组织,肿瘤组织组与癌旁组织组相比STAT3蛋白表达升高存在统计学差异(Z=-2.380P=0.017)；肿瘤组织的pSTAT3蛋白表达高于癌旁组织,肿瘤组织组与癌旁组织组相比pSTAT3蛋白表达升高有显著性差异(Z=-2.521 P=0.012)；肿瘤组织中AC-01蛋白与pSTAT3蛋白表达呈负相关,统计学有显著性意义(相关系数rs=-0.671,P=0.004)。结论本实验研究表明：①人大肠肿瘤中AC-01蛋白表达水平低于正常组织；②人大肠肿瘤中STAT3. pSTAT3蛋白表达水平均高于正常组织。③人大肠肿瘤中AC-01蛋白表达水平与pSTAT3蛋白表达水平为负相关,存在统计学意义。综合以上,根据STAT3为促癌基因的前期研究结果,由此推测AC-01为抗癌蛋白。第二部分 构建并鉴定载体及稳定细胞株实验一构建靶向AC-01的过表达载体及shRNA表达载体目的体外培养人结肠癌LOVO细胞株,提取质粒,构建过表达pBabe-puro-AC-01载体,同时设计并构建以AC-01为靶基因的pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表达载体,最终构建稳定细胞株。方法体外培养人结肠癌LOVO细胞株,根据NCBI提供的AC-01基因序列(NCBI登录号为XM 006714717)进行分析,以携带AC-01基因的质粒为模板,通过PCR扩增出AC-01基因的编码序列,构建了pBabe-puro-AC-01过表达载体。根据shRNA的设计原则,设计合成1个可干扰序列,及1个阴性对照序列,构建pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表达载体,并对其进行酶切鉴定和测序鉴定。最后抽提质粒。结果体外培养人结肠癌LOVO细胞株,设计合成AC-01基因的1个可干扰序列及阴性对照序列,成功构建了pBabe-puro/AC-01过表达载体及pSUPERretro-puro/AC-Ol/RNAi表达载体。使用碱裂解法成功完成pBaBe-Puro, pBabe-puro-AC-01, pSUPERretro-puro, pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi, PIK纯净质粒抽提,所得质粒经酶切鉴定及测序鉴定,证实了干扰质粒中含有目的基因的序列,重组质粒构建成功。实验二 构建稳定细胞株并鉴定目的筛选最高效序列AC-01/RNAi,逆转录病毒载体转染LOVO细胞株,筛选保留稳定细胞株,鉴定稳定细胞株并检测AC-01基因表达。方法使用脂质体法将pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表达载体转染人结肠癌LOVO细胞系,转染细胞分为4组,干扰对照组、AC-01/RNAi-1组、AC-01/RNAi-2组、AC-01/RNAi-3组,细胞转染72h后,应用RT-PCR法检测四组的AC-OlmRNA表达,并进行比较筛选最高效序列组；Western blot法检测各组AC-01蛋白表达改变并进行比较；筛选最高效序列AC-01/RNAi。磷酸钙法制备逆转录病毒,pBabe-puro/AC-01质粒及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi质粒已病毒为载体对LOVO细胞进行感染,感染结束后加入嘌呤霉素筛选阳性克隆,收集稳定细胞株,分为LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四组,RT-QPCR扩增稳定细胞株,western blot检测稳定细胞株的AC-01蛋白质并进行比较。分析转染后的效果。结果AC-01的RNA干扰重组体成功转染LOVO细胞后。RT-PCR法检测结果显示通过FTC-2000A检测各样本Ct值,三组间AC-01mRNA表达差异有显著性意义(P=0.027),其中AC-01/RNAi-2组AC-01基因表达量最高,AC-01/RNAi-3组次之,AC-01/RNAi-1组AC-01基因表达量最低。结合柱状图显示AC-01/RNAi-1组的AC-01mRNA表达最低,因此认为AC-01/RNAi-1组序列效果最佳。Westernblot法检测结果显示四组间AC-01蛋白表达差异有显著性意义(P=0.016),AC-01mRNA的表达由高到低：干扰对照组AC-01/RNAi-2组AC-01/RNAi-3组AC-01/RNAi-1组。结合柱状图显示AC-01/RNAi-1组的AC-01蛋白表达最低,因此认为AC-01/RNAi-1组序列效果最佳。成功将AC-01质粒及AC-01/RNAi-1质粒通过逆转录病毒转染LOVO细胞后分为LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四组。Western blot法检测分析结果表明,四组间AC-01蛋白表达差异有显著性意义(P=0.016),AC-01蛋白的表达由高到低：LOVO-AC-01组LOVO-scramble组LOVO-vector组LOVO-AC-01/RNAi组。结合柱状图显示LOVO-AC-01组的AC-01蛋白表达升高,LOVO-AC-01/RNAi组的AC-01蛋白表达降低。结论成功构建过表达pBabe-puro-AC-01载体及pSUPERretro-puro/AC-01/RNAi表达载体,筛选得到最高效序列AC-01/RNAi-1质粒,最终构建稳定细胞株,并成功验证。第三部分 AC-01对大肠癌细胞生物学特性的影响目的探讨AC-01对人结肠癌LOVO细胞增殖、分化、凋亡及侵袭性的影响。方法将AC-01质粒及AC-01/RNAi-1质粒通过逆转录病毒转染LOVO细胞,分为LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四组,①激光共聚焦观察转染阳性细胞和转染阴性细胞,并比较其细胞核、形态、及细胞数；②四氮唑蓝比色还原法(MTT法)检测AC-01对LOVO细胞生长的抑制效应,并通过RNA干扰后比较其变化；③Transwell体外侵袭实验进行癌细胞体外侵袭力分析。④划痕实验分别于划痕后Oh、12h、24h、36h每个孔随机取4个视野拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力,观察比较四组细胞愈合能力的变化。⑤对四组细胞进行3D-Culture实验,观察其形态变化并进行对比。结果AC-01质粒及AC-01/RNAi-1质粒成功通过逆转录病毒转染LOVO细胞,分为LOVO-vector, LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四组,①激光共聚焦观察转染AC-01阳性细胞,与周围对照细胞相比,细胞核显著减小；AC-01转染细胞表现为分化具有更多的突起,随AC-01重组蛋白浓度的增加,大肠癌细胞系LoVo细胞计数显著下降。②MTT法检测结果表明：四组中OD平均值有显著性差异(H=12.12,P=0.007),其相对增殖率亦有显著性差异(H=12.00,P=0.0074)。根据细胞生长趋势图显示LOVO-AC-01组中LOVO细胞增殖强度及速度均减弱,而LOVO-AC-01/RNAi组中LOVO细胞增殖强度及速度均增强；③侵袭实验结果表明：四组中侵袭细胞数有显著性差异(H=9.5848,P=0.02240.05)。根据柱状图显示LOVO-AC-01组中LOVO侵袭细胞数减少,而LOVO-AC-01/RNAi组中LOVO侵袭细胞数增加。④划痕实验结果表明：LOVO-AC-01组的细胞愈合率则弱于其他三组,LOVO-AC-01/RNAi组的细胞愈合率强于其他三组。⑤3D-Culture实验结果显示：LOVO-vector组及LOVO-scramble组中LOVO细胞变化不明显,LOVO-AC-01组的LOVO细胞表面触角明显收缩,表面变得平滑,LOVO-AC-01/RNAi组的细胞表面触角明显延长、增多,表面变得更加凹凸不平。结论本实验研究表明：①AC-01蛋白可以特异性地抑制癌细胞的增殖及侵袭能力,同时促进癌细胞凋亡,且效果显著；②通过特异性沉默AC-01基因表达,可以促进癌细胞增殖,增强其侵袭能力,且效果显著；③AC-01对大肠癌细胞系LoVo细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性。④AC-01蛋白是一种抗癌蛋白,可能成为大肠癌临床不良预后的一种分子标志,甚至成为大肠癌治疗的靶目标。第四部分 AC-01对大肠癌细胞的作用机制研究目的探讨AC-01通过调节大肠癌细胞内质网应激影响LOVO细胞的存活、肿瘤演进、血管形成及凋亡的机制。方法由于该蛋白的分布特征,我们推测该蛋白的表达可能与大肠癌细胞的内质网应激有关。因此,我们利用经典的衣霉素(Tunicamycin)诱导的内质网应激模型,对应激条件下该蛋白的表达特征进行了观察,检测AC-01蛋白及内质网应激标志物GRp78、GADD的表达,了解内质网应激与AC-01蛋白的关系。将AC-01质粒及AC-01/RNAi-1质粒通过逆转录病毒转染LOVO细胞,分为LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、LOVO-AC-01/RNAi四组,通过实时荧光定量PCR的方法,采用Sybrgreer染料法,以管家基因为内参基因,检测在不同组中内质网应激通路的标志物GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、 CDK2的表达,并对数据进行比较。Western-blot检测LOVO-vector、LOVO-AC-01、LOVO-scramble、 LOVO-AC-01/RNAi四组中内质网应激通路的标志物GRp78、PERK、XBP1、 ATF6、eIF2α、p-eIF2α、cyclinD1、CDK2的表达,以及由此影响其下游基因蛋白stat3、p-stat3、MMP2、MMP9的表达。结果Biacore 3000检测AC-01融合蛋白与Ca2+离子存在结合活性；Tunicamycin处理大肠癌细胞系LoVo导致细胞内质网应激后,GRp78和GADD的表达随tunicamycin浓度升高而增加,而AC-01蛋白的表达随tunicamycin浓度升高而减少。实时荧光定量PCR中,荧光扩增曲线呈平滑的S型,溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。实验结果提示：四组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表达有显著性差异(均P0.05)。根据柱状图显示LOVO-AC-01组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表达下调,而LOVO-AC-01/RNA组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、cyclinD1、CDK2的表达上调。Western-blot检测结果提示：四组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2α、 p-eIF2α、cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表达有显著性差异(均P0.05),根据柱状图显示LOVO-AC-01组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2a, p-eIF2α、 cyclinD1、CDK2、MMP2、MMP9的表达均下调,而stat3、p-stat3表达增高；LOVO-AC-01/RNA组中GRp78、PERK、XBP1、ATF6、eIF2a、p-eIF2α、cyclinD1、 CDK2、MMP2、MMP91的表达均增强,而stat3、p-stat3表达下降。结论本实验研究表明：①AC-01蛋白与内质网应激相关,可能是抑制内质网应激的损伤保护性蛋白；②AC-O1蛋白通过内质网应激影响UPR信号转导通路(PERK-eIF2A通路、ATF6通路和IRE1-XBP1通路),从而影响大肠癌LOVO细胞的存活、肿瘤演进及凋亡机制。③AC-01进一步抑制stat3、p-stat3及其相关蛋白MMP2、MMP9,从而影响大肠癌LoVo细胞的增殖及肿瘤血管形成。第五部分 小鼠体内实验验证AC-01对大肠癌细胞的影响目的通过动物实验探讨AC-01对大肠癌细胞的影响。方法分为LOVO-vector接种、LOVO-AC-01接种、LOVO-scramble接种、LOVO-AC-01/RNAi接种组。脂质体法转染chickenB-actin-RFP-NEO表达载体。裸鼠肿瘤细胞异种移植试验：雄性BALB/c裸小鼠皮下注射接种目标细胞,10毫克/公斤,每三天1次。肿瘤体积由长度(L)×宽度(W)2×0.5计算,用滑动卡尺测量和计算,自第七天后每三天记录1次,40天后小鼠处以安乐死,肿瘤称重,记录数据。结果随着时间和组别对于肿瘤体积都是有影响的,这种影响有统计学意义(均P0.0001),组别和时间有交互作用。四组间,肿瘤重量差异有统计学意义(P=0.0295)。根据柱状图显示,与对照组比较,LOVO-AC-01接种组中肿瘤生长速度下降,肿瘤的体积、重量均减少；而且LOVO-AC-01/RNAi接种组中肿瘤生长速度加快,肿瘤的体积、重量均明显增加。结论本实验研究表明：AC-01重组蛋白抑制裸小鼠体内大肠肿瘤的形成和生长；而AC-01/RNAi促进小鼠体内大肠肿瘤的形成和生长。
【关键词】：AC-01 RNA干扰 结肠癌 增殖 侵袭 凋亡 AC-01 内质网应激 大肠癌 增殖 凋亡 信号通路 AC-01 裸小鼠 结肠癌 异种移植 生长 AC-01 STAT3 结肠癌 AC-01 载体 质粒 结肠癌 酶切鉴定 测序鉴定 RNAi AC-01 质粒 结肠癌 稳定细胞株 RNAi
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-30
• 前言30-41
• 参考文献33-41
• 第一部分 人大肠癌细胞中AC-01的表达及其与STAT3的关系研究41-55
• 材料与方法41-47
• 结果47-52
• 讨论52-53
• 参考文献53-55
• 第二部分 构建并鉴定载体及稳定细胞株55-85
• 实验一 构建AC-01过表达载体及靶向AC-01的shRNA表达载体55-68
• 材料与方法55-66
• 结果66-68
• 实验二 构建稳定细胞株并鉴定68-81
• 材料与方法68-75
• 结果75-81
• 讨论81-84
• 参考文献84-85
• 第三部分 AC-01对大肠癌细胞生物学特性的影响85-103
• 材料与方法85-88
• 结果88-94
• 讨论94-100
• 参考文献100-103
• 第四部分 AC-01对大肠癌细胞的作用机制研究103-127
• 材料与方法103-105
• 结果105-120
• 讨论120-124
• 参考文献124-127
• 第五部分 小鼠体内实验验证AC-01对大肠癌细胞的影响127-134
• 材料与方法127-129
• 结果129-131
• 讨论131-134
• 结论134
• 参考文献134-136
• 综述136-145
• 参考文献142-145
• 攻读学位期间公开发表的论文145-146
• 致谢146-148
• 统计学审稿证明148

  本文关键词：抗癌蛋白AC-01对大肠癌细胞的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：369222