下调水通道蛋白-4在脑水肿时可能产生双刃剑作用的研究

发布时间：2017-05-16 04:01

  本文关键词：下调水通道蛋白-4在脑水肿时可能产生双刃剑作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究抑制水通道蛋白-4对不同损伤程度的体外模型和小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型产生的影响是保护作用还是加重损伤。1.通过转染水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)的siRNA、抑制钠-钾-氯共转运体(Na+-K+-Cl2-cotransporter, NKCC)和抑制促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)几种方法来抑制体外培养的大鼠星形胶质细胞AQP4的表达,然后对细胞进行不同程度的气压损伤。观察被下调了AQP4的大鼠星形胶质细胞气压损伤后水肿高峰时的情况。2.研究通过抑制促丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)的活性下调AQP4的表达,对不同程度小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑水肿、神经功能缺损评级的影响和组织发生凋亡的情况。方法1.原代培养SD大鼠星形胶质细胞。对培养成熟的星形胶质细胞进行不同压力的(1.0MPa、1.5MPa、2.0MPa和2.5MPa)气压损伤,观察各个压力损伤后细胞存活情况,并在损伤后3h测各组的AQP4的表达。选出适合的压力再用于进一步的实验。用两个不同的压力制造不同程度的细胞损伤,每个损伤程度下分阴性对照组(Control)、阳性对照组(T)、siRNA处理组、布美他尼处理组(bumetanide, BU)和p38-MAPK抑制剂(SB203580, SB)处理组。构建沉默AQP4 mRNA的siRNA,质粒瞬时转染大鼠星形胶质细胞,转染成功48h后进行气压损伤。布美他尼和p38-MAPK抑制剂均预处理星形胶质细胞30min后再进行气压损伤。损伤后在细胞水肿高峰3h利用流式细胞仪前向角散射光(forward side scatter, FSC)的强度与细胞大小成正比来检测细胞相对体积,判断细胞的水肿情况,用Western blot对AQP4的表达情况进行检测,并通过Annexin-V/PI染色法检测细胞凋亡和坏死程度。2.首先取健康成年昆明小白鼠90只,体重18-22g,随机分成阳性对照组(T1.5、T2.5)、p38-MAPK抑制剂组(SB1.5、SB2.5)和阴性对照组(C),每组18只。用线栓法制作不同程度的小鼠局部性脑缺血损伤模型(分别栓塞1.5h和2.5h后拔出线栓),SB组造模前30min分别给小鼠腹腔注射SB203580(20mg/kg)。按分组时间栓塞小鼠右侧大脑中动脉后再拔出,建立局灶性脑缺血再灌注模型,每组12只动物模型在术后24h水肿高峰时段处死取脑组织,6只用于干湿重法检测脑组织含水量；6只用于Western blot检测AQP4和Caspase-3的表达量。剩余的6只动物模型每日进行神经功能缺损评级,其中SB组每日腹腔注射SB203580一次,至第7天处死行病理切片观察脑组织损伤情况。3.结果1.原代培养大鼠星形胶质细胞生长良好,经转染AQP4的siRNA后明显下调了星形胶质细胞AQP4的表达。气压损伤后3h经流式细胞仪前向角散射光检测1.5MPa、2.0MPa压力损伤后阳性对照组细胞体积明显增大,2.0MPa阳性对照组体积明显大于1.5MPa阳性对照组(P0.05)。各干预组细胞体积均小于其阳性对照组。除1.5MPa损伤下的siRNA组和SB组外其余各组细胞体积均大于阴性对照组,且以2.0MPa阳性组增大最明显(P0.01)。1.5MPa压力损伤下的siRNA干扰组、布美他尼组和p38-MAPK抑制剂组星形胶质细胞水肿较阳性对照组减轻(P0.05),但发生凋亡的细胞也较阳性对照组增多(P0.05)。2.0MPa压力损伤后3h各组细胞均有较多死亡。Western blot检测发现siRNA干扰组、布美他尼组和p38-MAPK抑制剂组的AQP4表达均较其阳性对照组低(P0.05)。2.在1.5h和2.5h的缺血损伤程度下,24h时p38-MAPK抑制剂组(SB1.5、SB2.5)脑含水量和水通道蛋白的表达量都明显低于阳性对照组(T1.5、T2.5)(P0.05),但Caspase-3的表达量均高于阳性对照组。SB1.5组脑含水量和水通道蛋白的表达量与阴性对照比较无明显差异(P0.05)。其余组均高于阴性对照组并有统计学意义。在7天的神经功能缺损评级中。T1.5与SB1.5在7天总体的神经功能损伤评级比较中没有显著性差异,但均高于阴性对照组(P0.05)。T1.5组在第4天时小鼠的神经功能缺损评级降低,且低于SB1.5组(P0.05)。第7天时SB 1.5组的神经功能损伤评级也降低,同T1.5组比较没有显著差异(P0.05)。T2.5组7天总的神经功能缺损评级明显高于SB2.5组(P0.05)。结论1.大鼠星形胶质细胞在1.5MPa压力的气压损伤后3h,AQP4表达上调,细胞水肿。通过siRNA干扰、抑制NKCC和p38-MAPK信号途径可下调AQP4的表达减轻星形胶质细胞水肿。但AQP4在星形胶质细胞的修复、迁移中也发挥着重要的作用,抑制AQP4的表达在减轻水肿的同时也影响到了星形胶质细胞修复。另外细胞水肿本身也是对损伤的适应性反应,通过水肿稀释胞内因为损伤升高的离子浓度。所以可能在通过下调AQP4的时候也延缓了细胞的修复而介导了细胞的凋亡。另外由于细胞周围的空间并不是固定的,所以在阳性对照组细胞水肿的时候并没有因自身的水肿使周围压力继续上升而进步损伤细胞。2.0MPa的压力时,因细胞承受的压力的损伤较大,直接导致了大量细胞的坏死。在此实验中下调AQP4虽然能减轻细胞的水肿,但同时也促进了细胞的凋亡,从存活细胞数上并没有表现出保护作用。2.在小鼠局灶性脑缺血损伤,脑水肿形成中,通过抑制p38-MAPK信号途径,可抑制AQP4的表达,减轻脑水肿。可能在缺血1.5h的情况下并没有引起严重的脑水肿,所以T1.5组在水肿消退后神经功能得以恢复。而SB1.5组在下调AQP4的表达减轻水肿的同时也促使了一部分细胞发生凋亡,并可能抑制了AQP4介导的星形胶质细胞的迁移和修复功能,因此细胞的凋亡以及恢复的减慢,使得在第4、5天时出现损伤较T1.5组重的表现。但在缺血2.5h的情况下,因为较重的损伤使得损伤区域的脑组织水肿严重,颅内压升高,继而引起了周围脑组织的水肿形成恶性循环。所以阳性对照组的神经功能缺损评级较高。此时SB2.5组因抑制AQP4的表达减轻了脑水肿,并因部分细胞的凋亡缓解了颅内压的进步升高起到了保护作用。综合来看抑制AQP4的表达会产生双向性的作用,如何才能使利大于弊?需进步研究干预的时机。
【关键词】：水通道蛋白-4 脑水肿 siRNA 星形胶质细胞气压损伤 p38-MAPK NKCC
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中英文缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 引言15-19
• 参考文献17-19
• 第一部分下调AQP4对星形胶质细胞气压损伤后的影响19-66
• 一、星形胶质细胞气压损伤模型的构建20-28
• 1.材料与方法20-26
• 2.结果26-28
• 二、重组大鼠AQP4基因RNAi慢病毒载体质粒的构建及鉴定28-44
• 1.材料与方法28-41
• 2.结果41-44
• 三、pXPR1_011>AQP4·siRNA质粒瞬时转染星形胶质细胞44-51
• 1.材料与方法44-48
• 2.结果48-51
• 四、下调星形胶质细胞AQP4的表达对星形胶质细胞在1.5MPa和2.0MPa巧力损伤后的影响51-60
• 1.材料和方法51-55
• 2.结果55-60
• 讨论60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-66
• 第二部分 抑制不同程度小鼠局灶性脑缺血损伤后水通道蛋白-4的表达所产生的神经功能结果研究66-99
• 一、小鼠局部脑缺血再灌注后脑水肿和AQP4表达的情况67-80
• 1.材料与方法67-77
• 2.结果77-80
• 二、抑制AQP4的表达对不同程度小鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的影响80-93
• 1.材料与方法81-87
• 2.结果87-93
• 讨论93-96
• 结论96
• 参考文献96-99
• 综述一99-107
• 参考文献103-107
• 个人简历107
• 攻读学位期间发表文章情况107-108
• 致谢108

【参考文献】

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1 Wen-Zhen Shi;Chun-Zhen Zhao;Bing Zhao;Qiao-Juan Shi;Li-Hui Zhang;Yan-Fang Wang;San-Hua Fang;Yun-Bi Lu;Wei-Ping Zhang;Er-Qing Wei;;Aggravated inflammation and increased expression of cysteinyl leuko-triene receptors in the brain after focal cerebral ischemia in AQP4-deficient mice[J];Neuroscience Bulletin;2012年06期

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本文编号：369486