缺氧大肠癌细胞来源的外泌体通过Wnt4介导的β-catenin信号通路促进肿瘤血管新生及转移的机制研究
发布时间：2023-04-09 16:00
目的:大肠癌是一种世界性肿瘤,也是中国发病率上升最快的消化道恶性肿瘤。目前对于大肠癌的治疗主要手段仍为手术切除,早期大肠癌的预后相对较好,但多数患者就诊时已属晚期,且大多数患者已经发生转移。转移性大肠癌是癌症相关死亡最常见的原因之一,关于其发生发展机制的研究,受到研究者的广泛关注。大肠癌的转移,受到多种因素的影响,其中血管新生和自身转移在大肠癌的快速生长和转移过程中起着举足轻重的作用。肿瘤早期因其生产缓慢,消耗的氧气和营养物质极少,因而较少发生血管新生。若肿瘤早期没有发生血管新生,其瘤体生长不会超过3mm3。肿瘤后期,随着肿瘤细胞的不断生长,瘤体不断增大,导致肿瘤内部缺乏氧气和营养物质,这种缺氧以及营养缺乏的细胞外环境能刺激肿瘤细胞分泌多种血管新生相关因子和其他物质,诱导新血管的生成和肿瘤自身转移,为肿瘤内部细胞的快速生产提供充足的氧气和营养物质。在转移性大肠癌中,缺氧环境下,大肠癌细胞究竟通过何种机制新生血管和转移,对于抗肿瘤靶向药物的研发至关重要。外泌体是一种起源于胞内多囊体、由细胞主动分泌的大小约30nm-100nm的脂质双分子层小囊泡,几乎所有细胞均能产生...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文略缩语
第一部分 缺氧大肠癌细胞来源的外泌体通过Wnt4 介导的的β-catenin信号通路促进内皮细胞的血管生成
1 前言
2 材料和方法
2.1 主要试剂和仪器
2.1.1 主要材料与试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 步骤与方法
2.2.1 外泌体提取及浓度测定
2.2.2 Western Blot检测外泌体蛋白表达水平
2.2.3 慢病毒载体介导的HIF1α或 Rab27a/b沉默
2.2.4 CCK-8 试验检测细胞增殖情况
2.2.5 Transwell实验
2.2.6 外泌体RNA提取
2.2.7 RNA反转录成cDNA
2.2.8 qRT-PCR反应
2.2.9 裸鼠种瘤
2.2.10 免疫组化
2.2.11 统计学分析
3 结果
3.1 缺氧CRC细胞与常氧CRC细胞来源的外泌体提取
3.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖和迁移的作用
3.2.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖的作用
3.2.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的迁移的作用
3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的增殖和迁移的作用
3.3.1 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌
3.3.2 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的增殖的作用
3.3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的迁移的作用
3.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体中血管生长因子筛查及作用鉴定
3.4.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中血管生长因子筛查
3.4.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲减Wnt4的HUVEC的增殖作用
3.4.3 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲减Wnt4的HUVEC的迁移作用
3.5 Wnt4 上调依赖于缺氧,与HIF-1α相关
3.6 缺氧CRC细胞来源的Wnt4 激活的β-catenin信号通路在内皮细胞的增殖和迁移中的作用研究
3.6.1 缺氧CRC来源的外泌体对HUVEC的 β-catenin信号通路的影响
3.6.2 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞增殖的作用
3.6.3 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC来源的外泌体分泌后对内皮细胞迁移的作用
3.6 体外实验验证缺氧CRC细胞来源的外泌体对CRC生长和血管新生的作用
3.6.1 体外实验验证缺氧CRC细胞来源的外泌体对CRC生长的作用
3.6.2 体外实验验证缺氧CRC来源的外泌体对血管新生的作用
4 讨论
5 结论
第二部分 缺氧大肠癌细胞来源的外泌体通过将Wnt4传递到常氧细胞中促进大肠癌转移
6 前言
7 材料和方法
7.1 主要试剂和仪器
7.1.1 主要材料与试剂
7.1.2 主要仪器
7.2 步骤与方法
7.2.1划痕实验
7.2.2 HIF-1α敲减稳转株构建
7.2.3 Wnt4 敲减稳转株构建
7.2.4 其余实验方法基本同前
7.2.5 统计学分析
8 结果
8.1 缺氧CRC细胞与常氧CRC细胞来源的外泌体提取
8.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁移和侵袭能力的影响
8.2.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁移能力的影响
8.2.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞侵袭能力的影响
8.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞迁移和侵袭的影响
8.3.1 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌
8.3.2 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞迁移的影响
8.3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞侵袭的影响
8.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体诱导常氧CRC细胞的迁移和侵袭能力增加依赖于HIF-1α
8.4.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中HIF-1α水平检测
8.4.2 敲低HIF-1α的缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁徙的影响
8.4.3 敲低HIF-1α的缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞侵袭的影响
8.5 缺氧CRC细胞来源的外泌体中的Wnt4 通过依赖于HIF-1α的方式促进常氧CRC细胞的迁移和侵袭
8.5.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中Wnt4 水平检测
8.5.2 敲低缺氧CRC细胞HIF-1α来源的外泌体中Wnt4 水平检测
8.5.3 敲低缺氧CRC细胞HIF-1α来源的外泌体对常氧CRC细胞Wnt4 表达的影响
8.5.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲低Wnt4 的常氧CRC细胞迁徙的影响
8.5.5 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲低Wnt4 的常氧CRC细胞侵袭的影响
8.6 缺氧CRC细胞来源的Wnt4 激活的β-catenin信号通路在常氧CRC细胞的迁移和侵袭中的作用研究
8.6.1 缺氧CRC来源的外泌体对常氧CRC细胞β-catenin信号通路的影响
8.6.2 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞的迁移的影响
8.6.3 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞的侵袭的影响
9 讨论
10 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历
本文编号：3787321
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文略缩语
第一部分 缺氧大肠癌细胞来源的外泌体通过Wnt4 介导的的β-catenin信号通路促进内皮细胞的血管生成
1 前言
2 材料和方法
2.1 主要试剂和仪器
2.1.1 主要材料与试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 步骤与方法
2.2.1 外泌体提取及浓度测定
2.2.2 Western Blot检测外泌体蛋白表达水平
2.2.3 慢病毒载体介导的HIF1α或 Rab27a/b沉默
2.2.4 CCK-8 试验检测细胞增殖情况
2.2.5 Transwell实验
2.2.6 外泌体RNA提取
2.2.7 RNA反转录成cDNA
2.2.8 qRT-PCR反应
2.2.9 裸鼠种瘤
2.2.10 免疫组化
2.2.11 统计学分析
3 结果
3.1 缺氧CRC细胞与常氧CRC细胞来源的外泌体提取
3.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖和迁移的作用
3.2.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖的作用
3.2.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的迁移的作用
3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的增殖和迁移的作用
3.3.1 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌
3.3.2 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的增殖的作用
3.3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞的迁移的作用
3.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体中血管生长因子筛查及作用鉴定
3.4.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中血管生长因子筛查
3.4.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲减Wnt4的HUVEC的增殖作用
3.4.3 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲减Wnt4的HUVEC的迁移作用
3.5 Wnt4 上调依赖于缺氧,与HIF-1α相关
3.6 缺氧CRC细胞来源的Wnt4 激活的β-catenin信号通路在内皮细胞的增殖和迁移中的作用研究
3.6.1 缺氧CRC来源的外泌体对HUVEC的 β-catenin信号通路的影响
3.6.2 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对内皮细胞增殖的作用
3.6.3 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC来源的外泌体分泌后对内皮细胞迁移的作用
3.6 体外实验验证缺氧CRC细胞来源的外泌体对CRC生长和血管新生的作用
3.6.1 体外实验验证缺氧CRC细胞来源的外泌体对CRC生长的作用
3.6.2 体外实验验证缺氧CRC来源的外泌体对血管新生的作用
4 讨论
5 结论
第二部分 缺氧大肠癌细胞来源的外泌体通过将Wnt4传递到常氧细胞中促进大肠癌转移
6 前言
7 材料和方法
7.1 主要试剂和仪器
7.1.1 主要材料与试剂
7.1.2 主要仪器
7.2 步骤与方法
7.2.1划痕实验
7.2.2 HIF-1α敲减稳转株构建
7.2.3 Wnt4 敲减稳转株构建
7.2.4 其余实验方法基本同前
7.2.5 统计学分析
8 结果
8.1 缺氧CRC细胞与常氧CRC细胞来源的外泌体提取
8.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁移和侵袭能力的影响
8.2.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁移能力的影响
8.2.2 缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞侵袭能力的影响
8.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞迁移和侵袭的影响
8.3.1 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌
8.3.2 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞迁移的影响
8.3.3 抑制缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞侵袭的影响
8.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体诱导常氧CRC细胞的迁移和侵袭能力增加依赖于HIF-1α
8.4.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中HIF-1α水平检测
8.4.2 敲低HIF-1α的缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞迁徙的影响
8.4.3 敲低HIF-1α的缺氧CRC细胞来源的外泌体对常氧CRC细胞侵袭的影响
8.5 缺氧CRC细胞来源的外泌体中的Wnt4 通过依赖于HIF-1α的方式促进常氧CRC细胞的迁移和侵袭
8.5.1 缺氧CRC细胞来源的外泌体中Wnt4 水平检测
8.5.2 敲低缺氧CRC细胞HIF-1α来源的外泌体中Wnt4 水平检测
8.5.3 敲低缺氧CRC细胞HIF-1α来源的外泌体对常氧CRC细胞Wnt4 表达的影响
8.5.4 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲低Wnt4 的常氧CRC细胞迁徙的影响
8.5.5 缺氧CRC细胞来源的外泌体对敲低Wnt4 的常氧CRC细胞侵袭的影响
8.6 缺氧CRC细胞来源的Wnt4 激活的β-catenin信号通路在常氧CRC细胞的迁移和侵袭中的作用研究
8.6.1 缺氧CRC来源的外泌体对常氧CRC细胞β-catenin信号通路的影响
8.6.2 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC细胞来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞的迁移的影响
8.6.3 抑制β-catenin激活后,缺氧CRC来源的外泌体分泌后对常氧CRC细胞的侵袭的影响
9 讨论
10 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
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本文编号：3787321
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