益气小复方介导外泌体miR-423-5p阻滞三阴性乳腺癌顺铂耐药机制研究

发布时间：2023-04-19 02:07

　　目的:以人三阴性乳腺癌(TNBC)顺铂(DDP)耐药细胞株MDA-MB-231/DDP分泌外泌体(DDP-EXO)及其携带micro RNA为研究切入点,深入探讨TNBC顺铂耐药可能机制及益气小复方作用于外泌体阻滞TNBC顺铂耐药作用,为益气小复方逆转耐药提供实验依据。方法:以三阴性乳腺癌亲本细胞MDA-MB-231及其顺铂(platinum,DDP)耐药细胞MDA-MB-231/DDP为模型,采用过滤离心法提取MDA-MB-231/DDP外泌体(DDP-EXO);透射电子显微镜观察鉴定DDP-EXO形态;Western blot检测其CD63、TSG101、CD9的表达;用激光共聚焦显微镜追踪DDP-EXO与野生细胞MDA-MB-231的相互作用;使用micro RNA分析MDA-MB-231/DDP和MDA-MB-231外泌体中的micro RNA表达谱筛选差异显著micro RNA,RT-q PCR技术验证芯片预测结果;MTT测定、流式细胞术和Transwell实验确定外泌体micro RNA在体外对MDA-MB-231增殖、凋亡、迁移和侵袭能力影响;进一步通过MTT实验、流式细...

【文章页数】：115 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
引言
第一部分 MDA-MB-231/DDP外泌体(DDP-EXO)的提取、鉴定及在耐药中的作用
    1 实验材料
        1.1 细胞株
        1.2 主要实验试剂
        1.3 仪器与设备
        1.4 主要试剂的配制
    2 实验方法
        2.1 基本细胞实验
        2.2 过滤离心法提取外泌体
        2.3 顺铂制备
        2.4 外泌体电镜观察
        2.5 激光共聚焦显微镜观察细胞对外泌体摄取
        2.6 外泌体蛋白提取及定量
        2.7 外泌体 DDP-EXO 对 MDA-MB-231 细胞增殖能力影响
        2.8 蛋白免疫印迹实验(Western blot)
    3 统计方法
    4 实验结果
        4.1 外泌体形态鉴定
        4.2 外泌体相关标志蛋白的表达
        4.3 粒径分析
        4.4 野生细胞 MDA-MB-231 对 DDP-EXO 摄入情况
        4.5 DDP-EXO 与 MDA-MB-231 共培养后,耐药指数的变化
    5 讨论
    6 结论
第二部分 基于芯片技术分析MDA-MB-231/DDP外泌体耐药相关micro RNA
    1 实验材料
        1.1 细胞株及芯片技术
        1.2 试剂与耗材
        1.3 主要实验仪器
    2 实验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 外泌体提取及分组
        2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)
            2.3.1 mirVana^TM RNA Isolation Kit 提取细胞 Total RNA
            2.3.2 反转录 c DNA
            2.3.3 引物设计
            2.3.4 实时荧光定量 PCR
            2.3.5 结果分析方法
        2.4 芯片差异基因分析方法
    3 统计方法
    4 实验结果
        4.1 差异 microRNA 筛选及聚类分析
        4.2 Pathway分析
        4.3 micro RNA的 RT-q PCR验证
    5 讨论
    6 结论
第三部分 外泌体mi R-423-5p对 MDA-MB-231 细胞生物学行为影响
    1 实验材料
        1.1 细胞及药物同实验第二部分
        1.2 试剂与耗材
        1.3 主要仪器设备
    2 实验方法
        2.1 细胞共培养
        2.2 顺铂对细胞增殖抑制作用测定
        2.3 细胞凋亡检测
        2.4 划痕修复能力检测
        2.5 细胞迁移、侵袭能力检测
        2.6 细胞转染
    3 统计方法
    4 实验结果
        4.1 DDP-EXO 对 MDA-MB-231 凋亡的影响
        4.2 DDP-EXO 对 MDA-MB-231 侵袭能力的影响
        4.3 DDP-EXO 对 MDA-MB-231 划痕修复能力的影响
        4.4 过表达及干扰 mi R-423-5p 细胞增殖活力检测
        4.5 过表达及干扰 mi R-423-5p 细胞凋亡能力检测
        4.6 过表达及干扰miR-423-5p细胞划痕修复能力检测
        4.7 过表达及干扰miR-423-5p细胞侵袭能力检测
        4.8 RT-q PCR检测mi R-423-5p过表达及干扰后PTEN基因表达情况
        4.9 RT-q PCR检测PTEN过表达及干扰后mi RNA-423-5p表达情况
    5 讨论
    6 结论
第四部分 益气小复方调控外泌体DDP-EXO中 mi R-423-5p逆转TNBC顺铂耐药研究
    1 实验材料
    2 实验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 实验分组
        2.3 益气小复方的制备
        2.4 MTT 实验测定益气小复方对细胞增殖抑制作用
        2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
        2.6 划痕实验术检测细胞修复能力
        2.7 Transwell 实验检测细胞侵袭能力
        2.8 RT-q PCR 检测 miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表达
        2.9 Western blot 检测 PTEN、PI3K、AKT 蛋白的表达
    3 统计方法
    4 实验结果
        4.1 益气小复方对 DDP-EXO 诱导 MDA-MB-231 耐药细胞的增殖能力影响
        4.2 益气小复方对 DDP-EXO 诱导 MDA-MB-231 耐药细胞的凋亡能力影响
        4.3 益气小复方对 DDP-EXO 诱导 MDA-MB-231 耐药细胞的修复能力影响
        4.4 RT-q PCR 检测益气小复方对 DDP-EXO 诱导 MDA-MB-231 耐药细胞miRNA-423-5p、PTEN、p-AKT 的表达
    5 讨论
    6 结论
第五部分 益气小复方对外泌体诱导耐药移植瘤模型影响
    1 实验材料
        1.1 细胞株和药物
        1.2 实验动物
        1.3 主要试剂
        1.4 主要仪器设备
    2 实验方法
        2.1 细胞培养
        2.2 动物模型建立
        2.3 给药及分组
        2.4 实验动物体重及瘤块体积生长变化
        2.5 药物的抑瘤作用
        2.6 Real-time PCR 法检测相关 PI3K/AKT 信号通路基因表达
    3 统计方法
    4 实验结果
        4.1 给药期间各组实验动物体重变化
        4.2 各组实验动物体积及瘤重抑制率
        4.3 各组 mi RNA-423-5p、AKT、PTEN 基因表达水平
        4.4 Western blot检测各组PI3K/AKT信号通路中关键蛋白表达
    5 讨论
    6 结论
创新点
总结
致谢
参考文献
附录一:已发表文章
附录二 :文献综述 外泌体介导 mi RNA 在乳腺癌化疗耐药中的作用
    参考文献
附录三 已投稿待发表论文



本文编号：3793501