糖鞘脂GM1影响乳腺上皮细胞增殖和迁移的研究
发布时间：2023-04-23 00:21
糖鞘脂是一类含有亲脂性神经酰胺尾部和亲水性寡糖基头部、广泛分布于细胞膜表面的糖脂。GM1是一种含有唾液酸的糖鞘脂,具有维持细胞膜稳态,调控细胞增殖、粘附、识别和信号传导等重要作用,另外还参与了癌症的发生和发展。然而,GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的调控作用和相关分子机制仍不清楚。因此,研究GM1对乳腺上皮细胞增殖和迁移的影响,有助于深入了解GM1在乳腺癌发生发展中的作用,为乳腺癌的治疗提供实验基础。本课题以乳腺上皮细胞为研究对象,分析外源添加和内源改变GM1对细胞增殖和迁移的影响,提出GM1调控乳腺上皮细胞增殖和迁移的可能机制。主要研究结果如下:(1)外源添加GM1能够抑制乳腺上皮细胞在高密度时的细胞增殖。通过EdU细胞增殖、Western blot和流式细胞术等实验证实在高密度时,乳腺上皮细胞MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和SK-BR-3存在接触抑制生长现象。流式细胞术和薄层层析检测发现细胞在高密度时GM1表达显著升高。外源添加GM1能抑制高密度细胞增殖,抑制EGFR信号通路激活,但对常规密度细胞增殖没有影响。(2)内源过表达GM1能够抑制乳腺上皮细胞...
【文章页数】：128 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 前言
1.2 糖鞘脂概述
1.2.1 糖鞘脂的发现和历史
1.2.2 糖鞘脂的结构和命名
1.2.3 糖鞘脂的分布和功能
1.2.4 糖鞘脂在癌症中的表达与功能
1.3 乳腺癌概述
1.3.1 乳腺癌发展现状
1.3.2 乳腺癌分类
1.3.3 乳腺癌与糖鞘脂
1.4 细胞接触抑制概述
1.4.1 接触抑制的发现和历史
1.4.2 接触抑制的机理
1.5 上皮间质转化概述
1.5.1 EMT过程和作用
1.5.2 EMT相关信号通路
1.6 外泌体概述
1.6.1 外泌体的结构和形成
1.6.2 外泌体与细胞迁移
1.7 本课题的立体依据及主要研究内容
1.7.1 立体依据及研究意义
1.7.2 主要研究内容
第二章 外源添加糖鞘脂GM1对乳腺上皮细胞增殖的影响
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器
2.2.3 试剂配置
2.2.4 细胞培养
2.2.5 细胞复苏
2.2.6 细胞传代
2.2.7 细胞冻存
2.2.8 人乳腺上皮细胞生长曲线检测
2.2.9 EdU细胞增殖检测
2.2.10 蛋白质免疫印迹检测(Western blot)
2.2.11 流式细胞术检测GM1 含量
2.2.12 总糖鞘脂的提取与薄层层析检测
2.2.13 外源添加GM1 处理细胞
2.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路
2.3 结果与讨论
2.3.1 人乳腺上皮细胞增殖检测
2.3.2 常规密度和高密度细胞增殖检测
2.3.3 常规密度和高密度细胞EGFR信号通路检测
2.3.4 常规密度和高密度细胞中GM1 的表达检测
2.3.5 外源添加GM1 对细胞增殖的影响
2.3.6 外源添加GM1对EGFR信号通路的影响
2.3.7 外源添加GM1对EGFR信号通路激活的影响
2.4 本章小结
第三章 内源性改变GM1表达对乳腺上皮细胞增殖的影响
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.2.3 试剂配置
3.2.4 细胞培养
3.2.5 细胞总RNA提取
3.2.6 cDNA合成
3.2.7 PCR及质粒构建
3.2.8 B3GALT4 干扰载体构建
3.2.9 实时荧光定量PCR
3.2.10 细胞株构建
3.2.11 Western blot蛋白质免疫印迹检测
3.2.12 流式细胞术检测GM1或Gg4 含量
3.2.13 薄层层析免疫印迹检测
3.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路
3.3 结果与讨论
3.3.1 B3GALT4 慢病毒表达质粒的构建
3.3.2 GM1 过表达细胞株的构建
3.3.3 检测GM1 过表达细胞株中Gg4 的表达
3.3.4 B3GALT4 慢病毒干扰质粒的构建
3.3.5 GM1 敲低细胞株的构建
3.3.6 转染细胞增殖能力检测
3.3.7 转染细胞EGFR信号通路检测
3.3.8 转染细胞EGFR信号通路激活检测
3.4 本章小结
第四章 GM1 通过改变EGFR在脂筏中的分布调控细胞增殖
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 主要试剂
4.2.2 主要仪器
4.2.3 试剂配置
4.2.4 细胞培养
4.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测
4.2.6 细胞脂筏区和非脂筏区蛋白分的离提取
4.2.7 免疫共沉淀(Co-IP)
4.2.8 OptiPrep密度梯度离心
4.2.9 免疫荧光染色检测
4.2.10 MTS检测细胞增殖
4.3 结果与讨论
4.3.1 外源添加GM3 对细胞增殖和EGFR信号通路激活的影响
4.3.2 封闭GM1 对细胞增殖能力的影响
4.3.3 常规密度和高密度时EGFR在脂筏区和非脂筏区的分布检测
4.3.4 常规密度和高密度细胞中EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布检测
4.3.5 EGF刺激后常规密度和高密度细胞中EGFR在细胞膜上分布检测
4.3.6 外源添加GM1 处理对EGFR分布的影响
4.3.7 外源添加GM1对EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布影响
4.4 本章小结
第五章 GM1对乳腺上皮迁移的影响
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要试剂
5.2.2 主要仪器
5.2.3 试剂配置
5.2.4 细胞培养
5.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测
5.2.6 细胞悬滴聚集检测
5.2.7细胞贴壁实验
5.2.8 Transwell细胞迁移实验
5.3 结果与讨论
5.3.1 敲低和过表达GM1 对细胞形态的影响
5.3.2 敲低和过表达GM1 后细胞EMT marker的变化
5.3.3 敲低和过表达GM1 后细胞粘附能力的变化
5.3.4 敲低和过表达GM1 后对细胞迁移能力的影响
5.3.5 敲低和过表达GM1对TGF-β诱导发生EMT的影响
5.4 本章小结
第六章 GM1对癌细胞来源的外泌体促进受体细胞迁移的影响
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要试剂
6.2.2 主要仪器
6.2.3 试剂配置
6.2.4 细胞培养
6.2.5 流式检测细胞GM1 的表达
6.2.6 Western blot蛋白质免疫印迹检测
6.2.7 Transwell细胞迁移实验
6.2.8 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理MCF-10A细胞
6.2.9 MDA-MB-231和MCF-7 共培养体系建立
6.2.10 MDA-MB-231 细胞来源外泌体的提取
6.2.11 外泌体标志物检测
6.2.12 外泌体粒径检测
6.2.13 外泌体电镜拍照
6.2.14 外泌体密度梯度离心
6.2.15 外泌体处理MCF-10A细胞
6.3 结果与讨论
6.3.1 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对受体细胞GM1 含量的影响
6.3.2 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对MCF-10A细胞EMT的影响
6.3.3 MDA-MB-231和MCF-7 细胞共培养体系中MCF-7 细胞EMT变化检测
6.3.4 外泌体质量检测
6.3.5 外泌体GM1 的表达检测
6.3.6 两种细胞来源的外泌体GM1 表达差异检测
6.3.7 MCF-10A细胞摄入外泌体检测
6.3.8 外泌体处理对MCF-10A细胞EMT的影响
6.4 本章小结
主要结论与展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3798698
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 前言
1.2 糖鞘脂概述
1.2.1 糖鞘脂的发现和历史
1.2.2 糖鞘脂的结构和命名
1.2.3 糖鞘脂的分布和功能
1.2.4 糖鞘脂在癌症中的表达与功能
1.3 乳腺癌概述
1.3.1 乳腺癌发展现状
1.3.2 乳腺癌分类
1.3.3 乳腺癌与糖鞘脂
1.4 细胞接触抑制概述
1.4.1 接触抑制的发现和历史
1.4.2 接触抑制的机理
1.5 上皮间质转化概述
1.5.1 EMT过程和作用
1.5.2 EMT相关信号通路
1.6 外泌体概述
1.6.1 外泌体的结构和形成
1.6.2 外泌体与细胞迁移
1.7 本课题的立体依据及主要研究内容
1.7.1 立体依据及研究意义
1.7.2 主要研究内容
第二章 外源添加糖鞘脂GM1对乳腺上皮细胞增殖的影响
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要试剂
2.2.2 主要仪器
2.2.3 试剂配置
2.2.4 细胞培养
2.2.5 细胞复苏
2.2.6 细胞传代
2.2.7 细胞冻存
2.2.8 人乳腺上皮细胞生长曲线检测
2.2.9 EdU细胞增殖检测
2.2.10 蛋白质免疫印迹检测(Western blot)
2.2.11 流式细胞术检测GM1 含量
2.2.12 总糖鞘脂的提取与薄层层析检测
2.2.13 外源添加GM1 处理细胞
2.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路
2.3 结果与讨论
2.3.1 人乳腺上皮细胞增殖检测
2.3.2 常规密度和高密度细胞增殖检测
2.3.3 常规密度和高密度细胞EGFR信号通路检测
2.3.4 常规密度和高密度细胞中GM1 的表达检测
2.3.5 外源添加GM1 对细胞增殖的影响
2.3.6 外源添加GM1对EGFR信号通路的影响
2.3.7 外源添加GM1对EGFR信号通路激活的影响
2.4 本章小结
第三章 内源性改变GM1表达对乳腺上皮细胞增殖的影响
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.2.3 试剂配置
3.2.4 细胞培养
3.2.5 细胞总RNA提取
3.2.6 cDNA合成
3.2.7 PCR及质粒构建
3.2.8 B3GALT4 干扰载体构建
3.2.9 实时荧光定量PCR
3.2.10 细胞株构建
3.2.11 Western blot蛋白质免疫印迹检测
3.2.12 流式细胞术检测GM1或Gg4 含量
3.2.13 薄层层析免疫印迹检测
3.2.14 EGF刺激细胞激活EGFR信号通路
3.3 结果与讨论
3.3.1 B3GALT4 慢病毒表达质粒的构建
3.3.2 GM1 过表达细胞株的构建
3.3.3 检测GM1 过表达细胞株中Gg4 的表达
3.3.4 B3GALT4 慢病毒干扰质粒的构建
3.3.5 GM1 敲低细胞株的构建
3.3.6 转染细胞增殖能力检测
3.3.7 转染细胞EGFR信号通路检测
3.3.8 转染细胞EGFR信号通路激活检测
3.4 本章小结
第四章 GM1 通过改变EGFR在脂筏中的分布调控细胞增殖
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 主要试剂
4.2.2 主要仪器
4.2.3 试剂配置
4.2.4 细胞培养
4.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测
4.2.6 细胞脂筏区和非脂筏区蛋白分的离提取
4.2.7 免疫共沉淀(Co-IP)
4.2.8 OptiPrep密度梯度离心
4.2.9 免疫荧光染色检测
4.2.10 MTS检测细胞增殖
4.3 结果与讨论
4.3.1 外源添加GM3 对细胞增殖和EGFR信号通路激活的影响
4.3.2 封闭GM1 对细胞增殖能力的影响
4.3.3 常规密度和高密度时EGFR在脂筏区和非脂筏区的分布检测
4.3.4 常规密度和高密度细胞中EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布检测
4.3.5 EGF刺激后常规密度和高密度细胞中EGFR在细胞膜上分布检测
4.3.6 外源添加GM1 处理对EGFR分布的影响
4.3.7 外源添加GM1对EGFR在糖鞘脂富集区和小窝区的分布影响
4.4 本章小结
第五章 GM1对乳腺上皮迁移的影响
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要试剂
5.2.2 主要仪器
5.2.3 试剂配置
5.2.4 细胞培养
5.2.5 Western blot蛋白质免疫印迹检测
5.2.6 细胞悬滴聚集检测
5.2.7细胞贴壁实验
5.2.8 Transwell细胞迁移实验
5.3 结果与讨论
5.3.1 敲低和过表达GM1 对细胞形态的影响
5.3.2 敲低和过表达GM1 后细胞EMT marker的变化
5.3.3 敲低和过表达GM1 后细胞粘附能力的变化
5.3.4 敲低和过表达GM1 后对细胞迁移能力的影响
5.3.5 敲低和过表达GM1对TGF-β诱导发生EMT的影响
5.4 本章小结
第六章 GM1对癌细胞来源的外泌体促进受体细胞迁移的影响
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要试剂
6.2.2 主要仪器
6.2.3 试剂配置
6.2.4 细胞培养
6.2.5 流式检测细胞GM1 的表达
6.2.6 Western blot蛋白质免疫印迹检测
6.2.7 Transwell细胞迁移实验
6.2.8 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理MCF-10A细胞
6.2.9 MDA-MB-231和MCF-7 共培养体系建立
6.2.10 MDA-MB-231 细胞来源外泌体的提取
6.2.11 外泌体标志物检测
6.2.12 外泌体粒径检测
6.2.13 外泌体电镜拍照
6.2.14 外泌体密度梯度离心
6.2.15 外泌体处理MCF-10A细胞
6.3 结果与讨论
6.3.1 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对受体细胞GM1 含量的影响
6.3.2 MDA-MB-231 细胞条件培养基处理对MCF-10A细胞EMT的影响
6.3.3 MDA-MB-231和MCF-7 细胞共培养体系中MCF-7 细胞EMT变化检测
6.3.4 外泌体质量检测
6.3.5 外泌体GM1 的表达检测
6.3.6 两种细胞来源的外泌体GM1 表达差异检测
6.3.7 MCF-10A细胞摄入外泌体检测
6.3.8 外泌体处理对MCF-10A细胞EMT的影响
6.4 本章小结
主要结论与展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3798698
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