肠道菌群改变及纤维蛋白原γ链异常表达在肝细胞癌进展中的作用分析

发布时间：2023-10-27 18:42

　　目的1.利用高通量测序结合临床大数据分析肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)病人不同疾病进程中肠道菌群及肠型差异,在微生物层面筛选HCC标志物,建立特有预测模型从微生物组学水平评估HCC病人的预后。2.探索构建模型中高权重蛋白——纤维蛋白原γ链(FGG)在HCC疾病进程中的临床意义和生物学作用方法1.采集健康人(n=20例)和HCC病人术前(n=91例)、术后(n=82例)、术后复发(n=15例)的粪便样本,利用二代测序技术检测肠道菌群中的16srRNA序列,结合生物信息学方法筛选HCC不同疾病进程中发生高频改变的肠道菌属和肠型变化。利用统计学方法分析其与临床病理特征及预后的关系。2.以第一部分研究入组病人为研究对象,借助HCC临床大数据平台采集临床变量信息,构建全维度数据集,以基于机器学习理论的XGBoost算法构建HCC术后转移复发风险预测模型1(简称模型1);结合二元逻辑回归算法对全维度临床变量进行降维以构建降维数据集,同前法使用降维数据集构建模型2;将肠型分类变量纳入降维数据集生成综合数据集,同前法使用综合数据集构建模型3。通过预测准确率、ROC...

【文章页数】：163 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中英文缩略词
中文摘要
ABSTRACT
前言
    参考文献
第一部分 应用二代测序技术分析肝癌疾病进程中肠道菌群改变
    引言
    材料与方法
        1.研究对象
        2.临床资料收集及随访情况
            2.1 临床病理资料收集
            2.2 随访情况
        3.粪便样本采集
        4.主要仪器和试剂
            4.1 仪器
            4.2 试剂
        5.核酸抽提
        6.肠道菌群16S rRNA测序
            6.1 DNA质检
                6.1.1 实验准备
                6.1.2 配制检测工作液
                6.1.3 配制待检样品
                6.1.4 检测
            6.2 文库构建
            6.3 文库质检
            6.4 测序
        7.生物信息学分析
        8.统计学处理
    结果
        1.样本特征及分组
        2.Alpha多样性分析
        3.Beta多样性分析
        4.健康人群与HCC不同病程的菌群不同分类水平的相对丰度分析
            4.1 门水平物种分布特征
            4.2 纲水平物种分布特征
            4.3 目水平物种分布特征
            4.4 科水平物种分布特征
            4.5 属水平物种分布特征
        5.差异物种筛选
            5.1 健康对照组vs肝癌术前组
                5.1.1 Lefse分析
                5.1.2 基于物种绝对丰度分析
            5.2 肝癌术前组vs肝癌术后组
                5.2.1 lefse分析
                5.2.2 基于物种绝对丰度分析
            5.3 肝癌术前组vs肝癌术后组vs肝癌术后复发组
                5.3.1 配对样本差异物种筛选
                5.3.2 筛选差异物种的丰度变化
        6.HCC病人术前术后肠型分析
        7.根据肠型分类区分的HCC亚组分析
            7.1 肠型分类与临床病理特征的关联分析
            7.2 肠型分类与肝癌病人预后的关系
    讨论
    小结
    参考文献
第二部分 基于XGBOOST算法构建并优化数学模型评估肠型分类在肝癌转移复发预测中的价值
    引言
    资料与方法
        1.研究对象
        2.研究目标
        3.基于大数据方法学的临床数据挖掘及预处理
            3.1 数据来源
            3.2 数据挖掘
            3.3 获取全维度临床数据集
            3.4 筛选术后复发相关变量以获取降维数据集
                3.4.1 降维的需要
                3.4.2 二元逻辑回归算法介绍
                3.4.3 获取降维数据集
            3.5 综合数据集获取
        4.XGBoost算法及预测模型构建
        5.预测模型评价指标选择
    结果
        1.参与建模病例及训练集与测试集划分
        2.HCC术后转移复发风险预测模型构建
        3.预测模型评价
            3.1 模型预测准确率比较
            3.2 ROC曲线及AUC值比较
        4.变量权重排序
    讨论
    小结
    参考文献
第三部分 FGG通过激活EMT增强肝细胞癌的侵袭、迁移
    引言
    材料与方法
        1.标本
            1.1 细胞株
            1.2 组织样品采集
            1.3 各项临床病理诊断标准的确定
            1.4 临床病理学资料的收集
            1.5 随访方法
        2.主要试剂和耗材
        3.主要仪器
        4.实验方法
            4.1 RT-qPCR检测FGG mRNA的表达
                4.1.1 总RNA提取
                4.1.2 逆转录合成cDNA
                4.1.3 RT-qPCR
            4.2 Western Blot实验检测FGG蛋白的表达
                4.2.1 总蛋白的抽提
                4.2.2 蛋白浓度的测定
                4.2.3 蛋白的变性
                4.2.4 SDS-PAGE电泳
                4.2.5 蛋白转膜
                4.2.6 免疫反应
                4.2.7 显影
            4.3 免疫组化实验检测组织中FGG蛋白表达
                4.3.1 ElivisionTM plus二步法免疫组织化学法检测FGG蛋白表达
                4.3.2 免疫组化结果判断
            4.4 细胞培养
                4.4.1 细胞复苏
                4.4.2 细胞传代
                4.4.3 细胞的冻存
            4.5 质粒构建以及FGG稳定过表达细胞系的建立
                4.5.1 过表达的目的细胞株
                4.5.2 载体
                4.5.3 FGG全长引物设计
                4.5.4 质粒构建
                4.5.5 慢病毒包装及浓缩
                4.5.6 慢病毒感染细胞,构建稳定细胞株
                4.5.7 FGG稳定过表达细胞株的鉴定
            4.6 FGG基因表达沉默细胞株构建
                4.6.1 SiRNA的设计与合成
                4.6.2 细胞转染
                4.6.3 siRNA沉默效率验证
            4.7 细胞划痕实验
            4.8 细胞迁移和侵袭实验
                4.8.1 侵袭小室的制备
                4.8.2 细胞悬液的制备及侵袭实验
                4.8.3 细胞迁移实验
            4.9 检测EMT相关蛋白表达水平
            4.10 Slug、ZEB-1 表达沉默及表型验证
                4.10.1 制备Slug、ZEB-1 表达沉默的细胞株
                4.10.2 联合转染细胞株分组
                4.10.3 细胞表型鉴定
            4.11 ELISA检测过表达FGG的 SK-HEP-1 细胞上清液
            4.12 统计学分析
    结果
        1.肝癌组织中FGG表达高于癌旁肝组织
            1.1 Western Blot比较FGG蛋白表达水平
            1.2 RT-qPCR比较FGG mRNA表达水平
        2.FGG高表达与肝癌病人更具侵袭性的临床病理特征及不良预后相关
            2.1 免疫组化检测FGG表达
            2.2 FGG表达与临床病理特征的相关性分析
            2.3 FGG高表达与肝癌病人不良预后相关
        3.FGG过表达促进HCC的体外迁移和侵袭能力
        4.FGG表达沉默抑制HCC的体外迁移和侵袭能力
        5.FGG可诱导HCC细胞发生EMT
        6.Slug、ZEB-1对FGG调控HCC细胞迁移侵袭能力的影响
        7.过表达FGG的SK-Hep-1细胞的胞外FGG水平未上调
    讨论
    小结
    参考文献
综述
    参考文献
致谢



本文编号：3857063