p53新调控因子XBP1-u与p52-ZER6在肿瘤细胞周期调控的作用机制研究

发布时间：2024-05-12 06:30

　　细胞周期受各种细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin dependent kinases,CDKs)/细胞周期蛋白(Cyclins)复合体的严格调控,细胞周期调控机制出现异常与衰老、动脉硬化、阿尔兹海默症、肿瘤等各种疾病的发生发展紧密相关,所以至今对细胞周期的研究依然十分重要。癌症死亡率世界排名第二,严重影响人们生命安全和生活水平。细胞周期调控出现异常便会使细胞摆脱了严密的控制进入无限循环,是肿瘤发生发展的最基本原因。p21几乎可以和所有的Cyclins/CDKs复合体结合,抑制复合体功能,对准确的细胞周期运转十分重要。在许多肿瘤组织中p21的表达量都表现为显著降低,并且p21很少发生突变,因此阐明它的表达调控机制对深入理解细胞周期紊乱与肿瘤发生发展的关系极为重要。因此,课题组构建了一个包含3,354个shRNA表达载体的shRNA文库并利用含有p21启动子的报告基因体系,进行针对p21转录调控的高通量筛选。通过该筛选我们发现了多个新的p21上游调控因子。本论文中,我们针对通过上述筛选体系发现的p21后补抑制因子中的XBP1及ZER6对p53和p21的分子调控机制进行详细、深入的研究...

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

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1 前言
    1.1 研究意义
    1.2 国内外研究现状
        1.2.1 细胞周期调控
        1.2.2 细胞周期抑制因子p21与肿瘤
    1.3 研究目标
    1.4 本课题创新点
    1.5 研究方案
2 实验材料和方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 仪器
        2.1.2 试剂耗材
    2.2 实验方法
        2.2.1 质粒构建
        2.2.2 细胞实验
        2.2.3 动物实验
        2.2.4 临床组织样本
        2.2.5 双荧光素酶报告基因实验
        2.2.6 RNA提取和实时定量PCR(q PCR)
        2.2.7 蛋白质提取和蛋白质印迹分析
        2.2.8 CCK-8 测定细胞数量
        2.2.9 EdU标记细胞增殖实验和集落形成实验
        2.2.10 集落形成实验
        2.2.11 细胞周期分析
        2.2.12 蛋白质半衰期测定
        2.2.13 免疫共沉淀(以免疫沉淀MDM2,XBP1-u为例)
        2.2.14 连续免疫沉淀(以p53/MDM2/XBP1-u的连续免疫沉淀为例)
        2.2.15 细胞内泛素化测定(以测定p53 的泛素化为例)
        2.2.16 体内化学交联测定
        2.2.17 体外泛素化测定
        2.2.18 GST pull-down实验
        2.2.19 His融合蛋白的制备
        2.2.20 His pull-down实验
        2.2.21 免疫组化分析
        2.2.22 免疫荧光染色
        2.2.23 统计分析
第一部分
    3 应用shRNA表达质粒文库对p21转录活性进行高通量筛选
        3.1 引言
        3.2 实验目的
        3.3 实验结果与讨论
            3.3.1 验证用shRNA表达质粒文库筛选p21调控因子方法的可行性
            3.3.2 利用shRNA表达质粒文库和p21报告基因系统大量筛选p21转录调控候补因子
        3.4 本章小结
第二部分 探讨XBP1-u对p21转录活性的调控机制及其在肿瘤发生发展的影响
    4 XBP1-u负调控p21转录活性
        4.1 引言
        4.2 实验目的
        4.3 实验结果与讨论
            4.3.1 确认XBP1对p21转录水平的影响
            4.3.2 探讨XBP1对p21转录调控的普遍性
            4.3.3 探讨XBP1 两种剪切体对p21转录水平的作用机制
            4.3.6 XBP1-u/p21通路对细胞周期及细胞增殖的影响
        4.4 本章小结
    5 探讨p53在XBP1-u对 p21转录调控中的作用机制
        5.1 前言
        5.2 实验目的
        5.3 实验结果与讨论
            5.3.1 探讨p53在XBP1-u/p21信号通路中的作用机制
            5.3.2 解析XBP1-u对 p53 表达水平的调控机制
        5.4 本章小结
    6 探讨XBP1-u调控p53 泛素化的分子机制
        6.1 前言
        6.2 实验目的
        6.3 实验结果与讨论
            6.3.1 考察MDM2在XBP1-u通过调控p53/p21通路中的影响
            6.3.2 考察XBP1-u对 MDM2 表达水平的影响
            6.3.3 探讨XBP1-u对 MDM2 蛋白质水平的分子调控机制
            6.3.4 考察影响MDM2 蛋白稳定的XBP1-u关键区域
        6.4 本章小结
    7 XBP1-u/MDM2 通路对肿瘤发生十分关键
        7.1 前言
        7.2 实验目的
        7.3 实验结果与讨论
            7.3.1 在动物水平上探讨XBP1-u/MDM2 通路在肿瘤发生发展中的作用
            7.3.2 考察临床结肠癌样本中XBP1-u与 MDM2 及下游因子表达情况
        7.4 本章小结
    8 探讨XBP1-u与 MDM2对p53 的共同协调作用
        8.1 前言
        8.2 实验目的
        8.3 实验结果与讨论
            8.3.1 高表达情况下的XBP1-u和 MDM2对p53 的作用
            8.3.2 XBP1-u的功能与MDMX无关
        8.4 本章小结
    9 第二部分结论与讨论
第三部分 锌指蛋白p52-ZER6 通过促进p53 泛素化促进细胞增殖和肿瘤发展
    10 探讨ZER6对p53和p21的分子调控机制
        10.1 前言
        10.2 实验目的
        10.3 实验结果与讨论
            10.3.1 ZER6 亚型对P53及P21 表达量的影响
            10.3.2 探讨p52-ZER6对p53 蛋白质稳定性的影响
            10.3.3 考察p52-ZER6、p53 以及MDM2 蛋白质之间的结合
            10.3.4 探讨p52-ZER6 促进MDM2 诱导p53 蛋白质泛素化的分子机制
        10.4 本章小结
    11 p52-ZER6 通过TKRAB结构域调控MDM2/p53 通路
        11.1 前言
        11.2 实验目的
        11.3 实验结果与讨论
            11.3.1 分析p52-ZER6的N端和C端的细胞内分布
            11.3.2 考察p52-ZER6 蛋白质N端在调控MDM2/p53 通路的功能
            11.3.3 探讨p52-ZER6 蛋白质N端各结构域在调控MDM2/p53 通路的功能
        11.4 本章小结
    12 HUB-1 结构域抑制p52-ZER6对p53 的调控
        12.1 前言
        12.2 实验目的
        12.3 实验结果与讨论
        12.4 本章小结
    13 第三部分结论与讨论
全文总结与展望
参考文献
附录
    A.作者在攻读学位期间发表的论文目录
    B.作者在攻读学位期间主持或参与的基金项目
    C.作者在攻读学位期间获得的奖项
    D.学位论文数据集
致谢



本文编号：3971001